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大腸埃希氏菌（Escherichia coli）通常稱大腸桿菌，在 一定條件下可以引起人和多種動物發生胃腸道感染或尿 道等多種局部組織器官感染，是人體內較為常見的食源性 致病菌。近年來，因大腸桿菌污染水或食物造成人類食物 中毒的例子日益增多，該污染物給飲用水水質帶來了極大 的安全隱患。中華人民共和國國家標準《生活飲用水水質 衛生規范》規定，總大腸菌群及糞大腸菌群每 100mL 水樣 中不得檢出。因此，實現水質大腸桿菌的快速檢測顯得尤 為重要。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗材料
大腸桿菌 E. coli BL21、E. coli TG1 均由本實驗室保 存并提供。
1.1.2 試劑
pTA2 載體購自上海捷瑞生物公司，基因組提取試劑 盒、割膠回收試劑盒、質粒 DNA 小量提取試劑盒等均為上 海莊盟生物科技有限公司的產品。NaCl 為無錫市東昌化學 試劑有限公司產品，瓊脂粉、瓊脂糖、蛋白胨、酵母提取物 等化學試劑均購于上海澤衡生物技術有限公司。10×PCR buffer，MgSO（4 50mmol/L），dNTPS（2.0mmol/L），Taq 酶，50% DMSO，2×SYBR premix Ex-Taq 等均購于 TOYOBO 公司。 uida 基因片段相關引物均由上海生工生物技術有限公司 合成。
1.1.3 儀器
臺式高速冷凍離心機（德國西格瑪有限公司，Sigma 3K-15）；水平電泳系統（北京市六一儀器廠，DYCP-31D）；恒溫培養箱（太倉精宏儀器設備有限公司，JINGHONG）；恒 溫搖床（上海博迅實業有限公司，DSHZ-300A）；電泳成像 系統（上海天能科技有限公司，Tanon-2500）；超凈臺（蘇州 凈化設備有限公司，SW-CJ-IF）；水浴鍋（太倉精宏儀器有 限公司，JINGHONG）；熒光定量 PCR 儀（德國耶拿分析儀 器股份公司，MiniOpticon）；紫外-可見分光光度計（上海滬 粵明科學儀器有限公司，TU-1900）；圖像分析系統（Tanon， Image master VDS）。
1.2 方法
1.2.1 大腸桿菌 E.coli BL21 菌基因組提取
BL21 菌液培養至測到菌液吸光值為 OD=0.2-0.6 時， 根據上海莊盟生物科技有限公司基因組提取試劑盒說明 書對 BL21 菌進行總 DNA 的提取。質粒 DNA 提取方法參 考小量質粒抽提試劑盒內說明書。提取后的質粒 DNA 用 紫外分光光度計測定其 OD260/OD280 的數值。
1.2.2 PCR 擴增大腸桿菌 uida 保守基因片段
通過 GenBank 查找 uida 基因序列，通過 BLAST 比對 篩選出更為保守的基因片段約為 800bp，設計兩對 PCR 引 物（如表 1 所示），采用表 1 中的 uida-F/uida-R 引物，以大 腸桿菌基因組為模板，對大腸桿菌 uida 保守基因片段進行 常規 PCR 反應。反應體系共計 50μL，ddH2O 37.5μL，基因 組模板 1μL，10×PCR buffer 5μL，2mM dNTP 4μL，Taq 酶 （5U/μL） 0.5μL，上下游引物各 1μL。擴增反應程序如下： 94℃預變性 3min，94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1min，30 個循 環進行延伸；4℃保溫 10min。反應結束后，取 5μLPCR 產物 進行 1%瓊脂糖凝膠電泳，再由割膠回收試劑盒割膠回收， -20℃保存。
1.2.3 標準品重組質粒構建
將上述克隆的 uida 基因片段通過 TA 克隆方法與 pTA2 載體連接，反應體系如下：目的基因 7μL，pTA2 載體 1μL，T4 連接酶 1μL，T4 連接酶 buffer 1μL。16℃水浴連接 16h 后，將 uida 重組質粒轉化至 TG1 菌感受態細胞中，均 勻涂布到含氨芐的 LB 平板中，37℃培養 12-16h。挑取單菌 落培養過液后進行測序。抽提質粒進行 1%瓊脂糖凝膠電 泳鑒定，所獲得的重組質粒命名為 pTA2-uida。
1.2.4 熒光定量 PCR 條件優化
熒光定量 PCR 引物采用表 1 中的 quida-F1/quida-R1 的引物，通過優化熒光定量 PCR 反應體中退火溫度，退火 溫度選擇在 55~65℃范圍內，以 1℃作為梯度進行優化。最 佳條件根據擴增曲線的 Ct 值和熔解曲線來判斷。
2 結果與分析
選取 5 個梯度（103 ~107 copies/μL）的標準重組質粒，進 行熒光定量 PCR 檢測，曲線呈現 S 型，表明 Ct 值與濃度存在良好的線性關系。由此，以模板濃度對數 值為縱坐標，Ct 值為橫坐標建立熒光定量 PCR 檢測 E.coli 的標準曲線。曲線回歸的標準方程為：Y=- 0.3823X+12.172（直線斜率 A=-0.3823，截距 B=12.172，X= 模板濃度，單位為 copies/μL），且曲線的相關系數 R2 >0.98， 說明可信度較高。重復性測定 107 copies/μL、105 copies/μL、 103 copies/μL 高中低三個梯度質粒模板 Ct 值，計算平均值和變異系數。 可知，隨濃度降低，擴增曲線的標準差逐漸 增大，變異系數則始終小于 1%，則說明在合 理的誤差范圍內，建立的水質熒光定量 PCR 方法重復性好。
3 討論
大腸桿菌作為糞源性污染衛生細菌學 指標，在環境水質監測中起著非常重要的指 示作用。若水體中檢測出大腸桿菌則意味著 水質已被污染。分布在自然界的大腸桿菌 大多數是不致病的，主要附生在人或動物的 腸道里，為正常菌群，但少數的大腸桿菌具 有毒性，侵入人體時，可引起感染，如腹膜 炎、膽囊炎、膀胱炎及腹瀉等。對老人及小 孩的感染可能是致命性的。因此，我國在飲 用水方面的衛生標準限定 100ml 水樣中不 得檢測出大腸桿菌，該標準要求必須達到檢 出單個細菌的水平。
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