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微小 ＲＮＡｓ （ｍｉＲＮＡｓ）是一 類 由 １８～２５ｎｔ 組成的非編碼 ＲＮＡ，可通過直接與靶基因的３′端 非翻譯區 （３′－ＵＴＲ）相互作用調控靶基因的表達， 參與細胞的增殖、分化和凋亡等生物過程，與包括 食管癌在內的多種疾病的發生發展有密切關聯。 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ被證實在食管癌組織中表達下調，不 僅可通過靶 向 ＥＲＢＢ４、Ｉｒｆ２和 ＣＸＣＲ 參與 調 控 食 管癌的炎癥反應，還可通過靶向 ＥＲＢＢ４誘導癌細 胞凋亡和抑制細胞增殖；然而其 調 控 食 管 癌 細 胞增殖和凋亡的分子機制尚未見報道。上皮細胞轉 化序 列 ２ （ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ ２，ＥＣＴ２）基因被證實是一種重要的致癌基因，在 乳腺癌和肺腺癌等細胞增殖和凋亡過程中發揮重要作用。
１ 材料與方法
１．１ 細胞、主 要 試 劑 和 儀 器
人 食 管 癌 ＥＣ－１０９ 細 胞和人正常食管上皮 ＨＥＴ－１Ａ 細 胞 （美 國 ＡＴＣＣ公司）。胎牛血清 （蘭州民海生物工程有限 公司），ＲＰＭＩ－１６４０ 培 養 基 （美 國 Ｇｉｂｃｏ 公 司）， 胰 蛋 白 酶、 二 甲 基 亞 楓、 噻 唑 藍 （ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｙｌｄｉｐｈｅｎｙｌ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ， ＭＴＴ） 試 劑 （美 國 Ｓｉｇｍａ 公 司 ），ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ ｍｉｍｉｃｓ／ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及其 陰 性 對 照 片 段 （江 蘇 百 奧 邁 科 生 物 技 術 公 司）， 青 鏈 霉 雙 抗 混 合 液 （美 國 Ｇｅｍｉｎｉ公司），細 胞 周 期 蛋 白 Ｄ１ （ＣｙｃｌｉｎＤ１）抗 體、細 胞 周 期 蛋 白 依 賴 性 激 酶 ２ （ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｙｃｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１，ＣＤＫ２） 抗 體、ＥＣＴ２ 抗 體、Ｂｃｌ－２ 相 關 Ｘ 蛋 白 （Ｂｃｌ－２ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｘ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｂａｘ）抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨 酸 蛋 白 水 解 酶 ３ （Ｃｌｅａｖｅｄ ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－３，Ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３） 抗 體、 β肌動 蛋 白 （β－ａｃｔｉｎ） 抗 體 （武 漢 博 士 德 生 物 公司 ）， 硝 酸 纖 維 素 膜 （ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｆｉｌｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ，ＮＣ）（美國 Ｐｉｅｒｃｅ公司），辣根過氧化 酶標記的二抗 （北京中杉金橋生物有限公司），報 告基因表達 載 體 （美 國 Ａｍｂｉｏｎ公司），二喹 啉 甲 酸 （ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃａｃｉｄ，ＢＣＡ）蛋白 濃 度 測 定 試 劑 盒、電 化 學 發 生 （ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ， ＥＣＬ）試 劑 盒 （上 海 碧 云 天 生 物 技 術 研 究 所 ）， ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００、實時熒光定量 ＰＣＲ試劑盒、 ｃＤＮＡ 合 成 試 劑 盒 （美 國 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公 司 ）， ＴＲＩｚｏｌ總 ＲＮＡ 抽提 試 劑 盒 （北京百泰克生物公 司），雙熒 光 素 酶 檢 測 試 劑 盒 （美 國 Ｐｒｏｍｅｇａ公 司），細胞凋亡檢測試劑盒 （美國 ＢＤ 公司）。流式 細胞儀 （美 國 ＢＤ 公司），ＰＣＲ 擴增 儀 （美 國 ＭＪ 公司），ＵＶＰ 凝膠圖象分析儀 （英國 ＧｅｎｅＧｅｎｉｕｓ 公司），ＣＯ２ 細胞培養箱 （上海博迅醫療儀器有限 公司）。
１．２ 細胞培養
采用含有１０％胎牛血清和雙抗的 ＲＰＭＩ－１６４０培養基于體積分數為５％ＣＯ２、溫度為 ３７℃、飽 和 濕度細胞培養箱中培養 ＥＣ－１０９ 和 ＨＥＴ－１Ａ 細胞。每隔２ｄ更換新鮮培養液。待細胞 鋪滿瓶底 時，以０．２５％胰蛋 白 酶 消 化 傳 代。收 集 生長良好的對數生長期細胞進行實驗。
１．３ 細胞 分 組 和 轉 染
將 ＥＣ－１０９細胞 分 為 空 白 對照組 （未轉染）、ｍｉＲ－ＮＣ組 （轉染 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ ｍｉｍｉｃｓ陰 性 對 照）、ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ 組 （轉 染 ｍｉＲ－ ３０２ｂ－３ｐ ｍｉｍｉｃｓ）、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ＮＣ 組 （轉 染 ｍｉＲ－ ３０２ｂ－３ｐｉｎｈｉｂｉｔｏｒ陰 性 對 照） 和 ａｎｔｉ－ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ 組 （轉染 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐｉｎｈｉｂｉｔｏｒ），每組 設 ３ 個 復 孔。將 ＥＣ－１０９細胞以每孔５００μＬ （約３×１０６ 個） 接種至６孔細胞板上，培養箱內培養過夜。待細胞 貼壁生長 約 為７５％融合 時，參 照 ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００說明書步驟將配制的脂質體 ｍｉＲＮＡ 混合物按 照實驗分組加入到 ＥＣ－１０９細胞中。轉染６ｈ后更 換含胎牛 血 清 的 新 鮮 培 養 基。繼 續 培 養 ４８ｈ 后， 收集各組細胞進行后續實驗。
１．４ 實時熒光定量
ＰＣＲ 法檢測 ＨＥＴ－１Ａ 細胞和 ＥＣ－１０９細胞 中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ表達 水 平 收 集 未 轉 染的 ＨＥＴ－１Ａ 細胞、ＥＣ－１０９細胞和轉染４８ｈ的各 組 ＥＣ－１０９細胞，采用 ＴＲＩｚｏｌ法提 取 總 ＲＮＡ，采 用分 光 光 度 計 測 定 ＲＮＡ 的濃度和完整性。參照 ｃＤＮＡ 合成試劑 盒 說 明 書 步 驟 反 轉 錄 合 成ｃＤＮＡ。 以ｃＤＮＡ 為模板進行 ＰＣＲ擴增。２０μＬ反應體系： ２μＬｃＤＮＡ， 加 入 １０μＬ２× 定 量 ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、各 ０．０８ μＬ 上 下 游 引 物 （摩 爾 濃 度 為２０μｍｏｌ·Ｌ－１）、０．４ μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 （２．５Ｕ·μＬ－１）和 ６μＬｄｄＨ２Ｏ。ＰＣＲ 反 應 體 系： ９５ ℃ 預 變 性 ３ ｍｉｎ，９５ ℃ 變 性３０ｓ、６０ ℃ 復 性 ３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，共４０個循環。ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ 引物：Ｆ５′－ＡＴＣＣＡＧＴＧＣＧＴＧＴＣＧＴＧ－３′，Ｒ５′－ ＴＧＣＴＴＡＡＧＴＧＣＴＴＣＣＡＴＧＴＴ－３′； Ｕ６ 引 物： Ｆ５′－ＡＴＴＧＧＡＡＣＧＡＴＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＴＴ－３′， Ｒ５′－ＧＧＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧ－３′。 以 Ｕ６ 為內參，采 用 ２－△△Ｃｔ法 計 算 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ 的 相 對 表達水平。實驗重復３次。 １．５ ＭＴＴ 法 檢 測 各 組 ＥＣ－１０９ 細 胞 活 性 以 １０００ｒ·ｍｉｎ－１離心 ５ ｍｉｎ 后收 集 各 組 ＥＣ－１０９ 細 胞，調整細胞濃度為２×１０４ ｍＬ－１。以每孔１００μＬ 平鋪于９６孔細胞板上，每組設３個平行孔。置于 細胞 培 養 箱 內 常 規 培 養，分 別 在 培 養 ２４、４８ 和 ７２ｈ后向每孔中加入１０μＬ ＭＴＴ （５ｇ·Ｌ－１）溶 液孵育４ｈ，并以１００μＬ二甲基亞砜溶解 ＭＴＴ 結 晶。采用酶標儀在４５０ｎｍ 波長處檢測各組細胞的 吸光度 （Ａ）值，重復測量３次，取 Ａ 值平均值表 示各組細胞活性。
２ 結 果
食管癌 ＥＣ－１０９細胞中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ的表達水平 （１．００±０．０６）明顯低于正常食管癌上皮 ＨＥＴ－１Ａ 細胞 （０．２６±０．２８） （ｔ＝４．４７６，Ｐ＝０．０１１）。與 空白 對 照 組 比 較，ｍｉＲ－ＮＣ 組 和 ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ＮＣ 組 ＥＣ－１０９細胞 中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ的表達水平差異無統 計學意義 （Ｐ＞０．０５）；ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ組 ＥＣ－１０９細 胞中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ的表達水平較 ｍｉＲ－ＮＣ組明顯升 高 （Ｐ＜０．０５），ａｎｔｉ－ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ組 ＥＣ－１０９細胞 中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ表達水平較ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ＮＣ組明顯降 低 （Ｐ＜０．０５）。見
３ 討 論
腫瘤發生發展過程中往往伴隨著某些 ｍｉＲＮＡｓ 的異 常 表 達，而 這 些 ｍｉＲＮＡｓ在 腫 瘤 細 胞 增 殖、 侵襲、轉移和凋亡過程中發揮重要作用；其中， 作為 ｍｉＲ－３０２ 基 因 簇 家 族 中 的 重 要 代 表，ｍｉＲ－ ３０２ｂ在多種腫瘤的進程中扮演著重要角色。ｍｉＲ－ ３０２ｂ－３ｐ在胃癌組織和細胞中表達水平下調，上調 其 表 達 可 通 過 靶 向 胰 島 素 樣 生 長 因 子 １ 受 體 （ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－１ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＩＧＦ－１Ｒ）抑制 ＡＫＴ 信 號 通 路 的 激 活，影響周期相關蛋白 ＣｙｃｌｉｎＡ２、ＣｙｃｌｉｎＤ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ６ 和 凋 亡 蛋 白 Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２的表 達 發 揮 抑 制 細 胞 增 殖、細 胞 周 期 Ｇ１→Ｓ轉化并誘導細胞凋亡的作用。同時，ｍｉＲ－ ３０２ｂ 還 可 通 過 靶 向 調 控 ＥｐｈＡ２ 減 弱 Ｗｎｔ／ β－ｃａｔｅｎｉｎ／ＥＭＴ 信號 級 聯 通 路 抑 制 胃 癌 細 胞 的 增 殖、侵 襲 和 遷 移。在 惡 性 胸 膜 間 皮 瘤 細 胞 中， ｍｉＲ－３０２ｂ通過靶向 Ｍｃｌ－１抑制腫瘤細胞的增殖并 誘導細 胞 凋 亡。肝 癌 組 織 中 ｍｉＲ－３０２ｂ 表 達 降 低，ｍｉＲ－３０２ｂ過表 達 可 通 過 直 接 靶 向 Ａｋｔ２ 減弱 ＮＦ－κＢ和 ＭＭＰ－２ 的 表 達 抑 制 癌 細 胞 的 侵 襲 和 轉 移。此外，ｍｉＲ－３０２ｂ還可 通 過 靶 向 調 控 Ｅ２Ｆ１ 增強乳腺癌細胞對順鉑的敏感性，降 低 細 胞 活 性?？梢?，ｍｉＲ－３０２ｂ可通過調控多種靶基因或 途徑調控腫瘤的發生發展。
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