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咸鰳魚是浙東地區的傳統腌魚制品，因其肉質鮮 美且具獨特的“霉”香味而備受當地居民的喜愛。其加 工是以新鮮鰳魚為原料，不去除魚鱗、魚鰓及內臟，經 3 次加鹽腌制而成，加鹽量通常在 30 %~50 %。腌魚生 產過程實質上是一個復雜微生態體系在人為控制鹽 度、發酵溫度、濕度條件下，使微生物群落結構及功能 趨于人們期望的方向演化的過程。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
咸鰳魚：購于舟山、寧波、杭州蕭山水產品批發市 場，各采集 2 種樣品，依次編號為 A（腌制 90 d，25 ℃開 放腌制）、B（-18 ℃凍藏）、C（室溫 22 ℃攤放）、D（室溫 22 ℃攤放）、E（室溫 22 ℃攤放）、F（室溫 22 ℃攤放）。除 舟山市場采集的 A 樣品為商販自制咸鰳魚外，其余產 品均為東南亞進口咸鰳魚。 2216E 培養基：青島海博生物技術有限公司；DNA 提取試劑盒：北京莊盟生物科技有限公司；E.Z.N.A. R Stool DNA Kit、Taq DNA 聚合酶、DL2000 Marker：TaKaRa 寶成試劑有限公司。
1.2 主要儀器
超凈工作臺 SW-CJ-1CU、蒸汽壓力滅菌鍋 YXQSG46-280SA：上海博訊實業有限公司；高速冷凍離心 機 5810R：英國艾本德公司；超微量分光光度計 MN913、高速聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction， PCR）儀 A24811：美國賽默飛世爾公司；凝膠電泳系統 Tanon EPS600、凝膠成像系統 Tanon 4200：上海天能科技有限公司。
1.3 方法
采集鰳魚鰓后部、背部及腹部肉，剪碎混勻。同種 樣品挑選體態大小一致、個體完整的 3 尾魚，將其魚肉 混勻，稱取 25 g 魚肉樣品至含 225 mL 生理鹽水的錐 形瓶中，震蕩混勻后制備梯度稀釋液，并涂布于 2216E 培養基。選擇適宜的稀釋度進行菌落計數，并隨機挑 取 40 個菌落，純化 2 次~3 次后，接種于相應的液體培 養基中，靜置培養 24 h~48 h，制備 30 %的甘油菌液， -80 ℃凍藏備用。取 2216E 肉湯活化好的菌液 2 mL，按照試劑盒說 明書操作，提取菌株基因組 DNA。參考袁開等方法， 對分離菌株 16S rDNA 序列進行擴增，擴增產物測序 工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，基因序列 于 GenBank 中進行 BLAST 比對分析，部分序列結果提 交至 NCBI Genebank 數據庫。
2 結果與分析
采用 2216E 培養基對各樣品中可培養微生物進 行了計數與分離，咸鰳魚樣品在 2216E 培養基上的菌落數量集中分布于 4.9 log CFU/100 g~5.2 log CFU/100 g。 每組樣品隨機挑取 40 個菌落，經兩次純化后，從 A、C、 D、E、F 組樣品中共分離到 151 株可培養菌 （B 組樣品 微生物傳代后均未生長）。分離菌株經過提取基因組、 擴增獲得 16S rDNA 序列，測序結果經與美國國立生 物技術信息中心（National Center for Biotechnology In－ formation，NCBI）數據庫比對分析，將其鑒定至種、屬 水平，具體結果見表 3。將部分序列提交至 Genebank 數據庫，獲取序列編號為 MK205156~MK205178。芽孢桿菌屬是一類廣泛分布在土壤和水圈中的 細菌，在海洋環境中有大量分布。市售咸鰳魚中的芽 孢桿菌屬細菌，可能來源于鰳魚自身的生存環境，也 可能在加工或保藏中混入。通常情況下，添加米飯等 淀粉質原料的發酵魚制品生產中，芽孢桿菌屬細菌會 成為優勢菌，并且具有較為豐富的多樣性。在高鹽 腌制海產品中，枯草芽孢桿菌僅可能少量存在于產品 中。A、D、E、F 組樣品中，枯草芽孢桿菌數量占據絕對 優勢。咸鰳魚加工原料中未加入淀粉質原料，且加鹽 量達魚體重的 30 %~50 %，因此，大量的芽孢桿菌可能 來源于生產后的貯藏或運輸中。
3 討論
基于分離培養研究技術從市售咸鰳魚中獲得 151 株可培養微生物，16S rDNA 序列分析顯示，分離菌株 可歸至 14 個屬和 23 個種。芽孢桿菌屬細菌是 A、D、 E、F 組樣品中優勢微生物；C 組樣品中葡萄球菌為優 勢菌，嗜冷桿菌和芽孢桿菌數量次之。上述 3 個屬以 外的其他種屬細菌在各類樣品中均呈零星分布的狀 態。然而，免培養高通量測序結果在屬水平上反映出 的微生物種類與分離培養方法不盡相同。Illumina MiSeq 測序結果顯示，C、D、E、F 組 中 狹 義 梭 菌 屬 （Clostridium sensu stricto）和分類梭菌科（Clostridiaceae unclassified）微生物數量最多是其中的主要優勢菌，而 A 組樣品中堿桿菌屬 （Alkalibacillus）、嗜鹽古生菌 （Natrinema） 幾乎占據了主導地位，B 組樣品則以慢性 芽孢桿菌屬（Lentibacilus）為主。
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