發酵食品抗氧化乳酸菌的篩選(博迅SPX-250B-Z使用

１９５６年 英 國 學 者 Ｈａｒｍｎａ首 先 提 出 了 自 由 基 衰老學說。自由基衰老理論（ＦＲＴＡ）認為細胞的老化變化是由自由基反應引起的。１９９０年 美 國 衰 老研究權威Ｓｏｈａｌ教授指出了自由基衰老理論的缺陷，并首次提出了氧化應激的概念。氧化 應 激 即 機體自由基生成增加或清除能力降低，引起機體氧 化系統和抗氧化系統的功能紊亂，導致自由基在體 內積累而引起的一系列氧化損傷過程。多種研究 證明：氧化應激不僅與衰老有著密不可分的關系，氧 化應激還與腫瘤的發生，哮喘、抑郁癥及各種慢性炎 癥等疾病息息相關。氧化應激還 參 與 心 血 管 疾 病的病理生理過程，引發動脈粥樣硬化、心力衰竭、 高血壓和心肌損傷等。

１ 材料與方法

１．１ 材料與儀器

傳統自制的發酵蔬菜：蘿卜、白菜、長豇 豆 和 芥 菜；嬰兒糞便，采 集 于２５ｄ健 康 嬰 兒；ＭＲＳ液 體 培 養基：蛋白 胨 １０．０ｇ／Ｌ，牛 肉 膏 １０．０ｇ／Ｌ，酵 母 膏 １０．０ｇ／Ｌ，檸檬酸二銨２．０ｇ／Ｌ，乙酸鈉５．０ｇ／Ｌ，硫酸鎂０．５８ｇ／Ｌ，硫 酸 錳０．２５ｇ／Ｌ，磷 酸 氫 二 銨２．０ ｇ／Ｌ，葡萄糖２０．０ｇ／Ｌ，吐 溫－８０１ｍＬ；二 苯 基 苦 基 苯肼自由基（Ｓｉｇｍａ生物試劑有限公司）；ＤＮＡ 抽提 試劑盒，由生工生物工程（上海）股份有限公司出品； ＡＰＩ５０試劑條（生物梅里埃中國有限公司）；鄰菲羅 琳、過氧化氫、硫酸亞鐵和抗壞血酸等試劑（均為國 產分析純）。 生化培養箱（型 號 博迅SPX-250B-Z，上 海 博 迅 實 業 有限公司）；紫 外／可 見 分 光 光 度 計（型 號 ＵＶ１０００， 上海天美科學儀器有限公司）；超聲波破碎儀（ＳＯＮ－ ＩＣＳ，型號 ＶＣＸ５００）；臺式高速冷凍離心機（Ｔｈｅｒ－ ｍｏ，型號Ｓｔｒａｔｏｓ）；聚合酶反應 儀（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，型 號 Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ）。

１．２ 實驗方法

１．２．１ 樣品的采集

使用一次性無菌注射器采集發酵蔬菜的湯汁， 保存于已滅菌的 ＥＰ管中。對嬰兒糞便進行無菌采 集，采樣后樣品封口膜封口，均保存于４ ℃備用。

１．２．２ 乳酸菌的分離純化

將樣品用生理鹽水進行梯度稀釋，將稀釋后的 樣品均勻涂布于ｐＨ 為５．０的 ＭＲＳ固體培養基上， 放入３７ ℃普通培養箱培養２４～４８ｈ。 觀察菌落形態，挑選符合乳酸菌形態的菌落進 行３次劃線純化。對純化后的菌落進行革蘭氏染色 和接觸酶實驗。革蘭氏染色陽性，接觸酶實驗為陰 性的菌株可初步判定為乳酸菌。

１．２．３ 乳酸菌耐受性實驗

１）乳酸菌的耐酸性測定：將活化后的菌株，以 ３％的接種量分 別 接 種 于 ｐＨ 為２．０，３．０，４．０，６．０ 的 ＭＲＳ液體培養基中，３７ ℃培養１６ｈ。１６ｈ后測 其在６００ｎｍ 處的吸光值。
２）乳 酸 菌 的 膽 鹽 耐 受 能 力 測 定：將 活 化 的 菌 株，以３％的接種量接種于分別含有０，０．３％，０．５％ 豬膽鹽的 ＭＲＳ液體培養基中，３７ ℃培養１６ｈ。１６ ｈ后測其在６００ｎｍ 處的吸光值。
３）乳酸菌的過氧化氫耐受能力測定：將活化的 菌株按３％接 種 于 過 氧 化 氫 濃 度 分 別 為 ０．４，０．７， １．０ｍｍｏｌ／Ｌ的 ＭＲＳ液 體 培 養 基 中，３７ ℃培 養１６ ｈ。１６ｈ后測其在６００ｎｍ 處的吸光值。

１．２．４ 乳酸菌體外抗氧化能力測定

１）樣品的處理 樣品處理 參 考 Ｌｉｎ等的 方 法。完 整 細 胞 懸 液：將菌以１％接種于 ＭＲＳ液體培養基，３７ ℃培養 １６ｈ后４℃，４０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，棄上清，收集 菌體，收集的菌體經 ＰＢＳ（ｐＨ 為７．
２）洗滌３ 次，再懸浮于 ＰＢＳ中，調整菌數至１×１０９ｃｆｕ／ｍＬ。 胞內提 取 物：將 上 述 菌 數 為１×１０９ ｃｆｕ／ｍＬ 的 完整細胞懸液激進行超聲破碎，功率４００ Ｗ，工作５ ｓ，停５ｓ，６０ 次。破碎后將懸液４ ℃，１００００ｒ／ｍｉｎ 離心１０ｍｉｎ，收集上清。 ２）ＤＰＰＨ 清除能力測定 ?。埃玻恚恚铮欤恚?的 ＤＰＰＨ１ｍＬ，加１ｍＬ 處 理過 的 乳 酸 菌 樣 品 充 分 混 勻 后，室 溫 避 光 反 應 ３０ ｍｉｎ，６０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，取上清，測定其在波 長５１７ｎｍ 處 的 吸 光 度 Ａｉ，對 照 組（ＡＯ ）以 等 體 積 ＰＢＳ 代 替 樣 品。 以 等 體 積 ＰＢＳ 和 無 水 乙 醇 調 ０，其表達式為 清除率＝ＡＯ－Ａｉ ＡＯ ×１００％ ３）羥自由基清除能力測定 ?。保恚痰泥彿屏_琳（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），加入 ＰＢＳ １ｍＬ，蒸餾水１ｍＬ，充分混勻后加入１ｍＬ 硫酸亞 鐵（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），再次充分混勻，加１ｍＬ過氧化氫 （濃度為２０ｍｍｏｌ／Ｌ）。將上述反應液于３７ ℃水浴 １．５ｈ后在５３６ｎｍ 處測定其吸光度 Ａｐ；用１ｍＬ蒸 餾水代替過氧 化 氫 為 Ａｂ；用１ｍＬ 樣 品 代 替１ｍＬ 蒸餾水為Ａｓ ，其表達式為 羥自由基清除率＝Ａｓ－Ａｐ Ａｂ－Ａｐ ×１００％ ４）抗脂質過氧化能力測定 在新鮮的雞蛋黃中１︰１加入 ＰＢＳ，磁力攪拌 １０ｍｉｎ后用 ＰＢＳ稀釋成１︰２５的蛋黃懸液。?。?ｍＬ蛋 黃 懸 液，０．５ ｍＬ 樣 品，１ ｍＬ ＰＢＳ 和 １ ｍＬ ＦｅＳＯ４（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）溶液混勻，３７℃保溫１．５ｈ。然 后加入１ｍＬ三氯乙酸（ＴＣＡ，質量分數為２．５％）， 室溫靜置１０ｍｉｎ，３５００ｒ／ｍｉｎ，離 心１０ｍｉｎ。取 上 清加入２ｍＬ 的 硫 代 巴 比 妥 酸（ＴＢＡ，質 量 分 數 為 ０．８％），充 分 混 勻 后 沸 水 浴 １０ ｍｉｎ；冷 卻 后 于 ５３２ ｎｍ 處測定 吸 光 度 Ａ１。Ａ０ 用等量的樣品溶劑（即 ＰＢＳ）代替樣品，其表達式為 脂質過氧化抑制率＝Ａ０－Ａ１ Ａ０ ×１００％ ５）還原活性分析 在０．５ｍＬ的菌懸液中依次加入０．５ｍＬＰＢＳ， ０．５ｍＬ鐵氰化 鉀（質 量 分 數 為１％），５０ ℃水 ?。玻?ｍｉｎ，迅 速 冷 卻 后 加 入 ０．５ ｍＬ１０％ 的 三 氯 乙 酸， ４０００ｒ／ｍｉｎ離心５ｍｉｎ。取 上 清１ｍＬ 加 入１ｍＬ 蒸餾水和三氯 化 鐵（質 量 分 數 為０．１％）混 合 均 勻， 反應１０ｍｉｎ后于７００ｎｍ 處測定其吸光值，用 Ｌ－半 胱氨酸作為標品。

１．２．５ 菌種鑒定

１）１６ＳｒＤＮＡ：將乳酸菌ＺＪ４０１過夜培養后，取適 量菌液利用試劑盒提取全基因組。得到的全基因組用 １６Ｓ通用引物進行ＰＣＲ（２７Ｆ：５＇－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧ－ ＧＣＴＣＡＧ－３＇；１４９２Ｒ：５＇－ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－ ３＇），將 ＰＣＲ 產物送至公司進行測序。將測序結果在 ＮＣＢＩ上進行ＢＬＡＳＴ比對。 ２）ＡＰＩ５０ＣＨ菌種鑒定：用 ＡＰＩ５０ＣＨ及 ＡＰＩ５０ＣＨＬ 進行乳酸菌的生理生化鑒定，操作步驟按照說明書進行。 ３）生長曲線分析：?。担埃恚?已發酵２４ｈ的菌 液離心棄上清，用生理鹽水洗滌后再離心棄上清，置 于烘箱中烘干至恒重（６５ ℃，２４ｈ），測其干重，以此 為依據分別計算出１，２，４，５，６，８，１０ｍＬ發酵液 的菌體干重。另?。?，２，４，５，６，８，１０ｍＬ菌液， 離心棄上清后用生理鹽水重懸浮混 勻定容至 ２５ ｍＬ，分別測其 ＯＤ６００ｎｍ，得到吸光值 ＯＤ６００ｎｍ與菌體 干重的生物量標準曲線。另以１％的接種量將乳酸 菌ＺＪ４０１接種于 ＭＲＳ液體培養基中，每隔２ｈ取一 定量菌液進行ＯＤ６００ｎｍ測定和ｐＨ 測定。

１．２．６ 統計分析

每個實驗重復３ 次，采用 ＳＰＳＳ１９．０的單因素 方差分析顯著性差異。

２ 結果與討論

芬頓反應是過氧化氫和二價鐵離子催化反應 生成具有強氧化能力的羥基自 由 基，目 前 芬 頓 反 正也廣泛應用于抗氧化能力的評價實驗中。乳酸菌要順利到達腸道，除了需要具有一定的耐 酸能力以外，還需要具有一定的膽鹽耐受能力，正常人 體腸道中膽鹽質量分數在０．０３％～０．３％波動，乳酸菌 在此膽鹽濃度下具有活性就有可能在腸道中定植。ＤＰＰＨ（１，１－二 苯 基－２－三 硝 基 苯 肼）自 由 基 清 除實驗常用于抗氧化能力的評價實驗中。當 自 由 基 清 除 劑 存 在 時，ＤＰＰＨ 自由基接受一個 電子或 氫原子，形成穩定的 ＤＰＰＨ－Ｈ 化合物，使 其 乙 醇 溶 液從深紫 色 變 為 黃 色，變色程度與其 接受的電子 數量（自由基清 除 活 性）成 定 量 關 系，因 而 可 用 分 光光度計進行快速的定量分析。

３ 結 論

隨著科技進步和生活水平的提高，細胞抗氧化 與抗衰老越來越多地為人們所關注。細胞氧化應激 損傷與衰老及多種疾病都有著密不可分的關系。本 實驗從各種發酵食品中篩選得到３４株乳酸菌，經耐 酸耐膽鹽及耐過氧化氫實驗得到６株耐受性較好的 乳酸菌，通過 ＤＰＰＨ 清除率，羥自由清除率，還原活 性，抗脂質過氧化率實驗對菌株的體外抗氧化性進行了鑒定，確定了一株具有優良抗氧化性的短乳桿 菌，命名為ＺＪ４０１。ＺＪ４０１具備優良的體外抗氧化活 性和益生性能，為后續乳酸菌的菌種選育，食品發酵 工業中功能性抗氧化食品發酵劑的研制，以及新型 的益生活菌制劑的開發奠定基礎。

 

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