土霉素生物轉化的研究-YXQ-75SII使用

土霉素是１種廣譜抗生素，對立克次體屬、支 原體屬等 多 種 致 病 菌 具 有 強 的 抗 菌 作 用。然 而， 由于長期以 來 土 霉 素 的 廣 泛 應 用，臨 床 常 見 病 原 菌，例如葡萄 球 菌 等 革 蘭 陽 性 菌 及 多 數 革 蘭 陰 性 桿菌，對土霉素耐藥現象嚴重。土霉素屬于四環 素類的抗生素，其性質穩定，由于大量使用導致環 境中過多殘留（土壤甚至海洋），且不易被降解，造 成環境中藥物的嚴重污染。環境中的土霉素極 易引起耐藥菌的產生，對農作物、牲畜乃至人類產 生不利影響，人 類 急 需 尋 求１種有效的方法對環 境中的土霉素進行降解。

1 實驗部分

１．１ 儀器與試劑

超 凈 工 作 臺 （蘇 凈 集 團 安 泰 公 司 ）；ＺＳＤ－ Ａ１１６０全自動新 型 生 化 培 養 箱（上海智城分析儀 器有限公司）；上海博訊YXQ-75SII型立式壓力蒸汽滅 菌鍋 （上 海 博 訊 實 業 有 限 公 司 醫 療 設 備 廠 ）； ＬＡＢＯＲＯＴＡ ４０００－ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ 旋 轉 蒸 發 儀 （德 國 Ｈｅｉｄｏｐｈ公司）；ＡＬ１０４萬分 之 一 電 子 天 平（瑞 士 Ｍｅｔｔｌｅｒ－Ｔｏｌｅｄｏ公 司）；ＪＥＯＬＪＮＭ－ＥＣＰ６００ 型 核磁共振波譜 儀（５００ ＭＨｚ）（日本 電 子 株 式 會 社）； ＡｇｉｌｅｎｔＤＤ２５００ ＭＨｚ（安捷倫科技有限公司）； ＴｈｅｒｍｏＤＳＱＥＩ－ｍａｓｓ型質譜儀（美國 Ｔｈｅｒｍｏ公 司）；高效液相色譜儀 ＨｉｔａｃｈｉＬ－２０００ ＨＰＬＣ，Ｈｉ－ ｔａｃｈｉＬ－２５４５檢測器（日本 Ｈｉｔａｃｈｉ公司）；Ｋｒｏｍａ－ ｓｉｌＣ１８柱 （５μｍ，２５０ ｍｍ×１０ ｍｍ，瑞 典 Ｅｋａ 公 司）；Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ－２０ 凝 膠 柱 色 譜 填 料 （Ａｍｅｒ－ ｓｈａｍ 公司）；硅膠２００～３００目（青島 海 洋 化 工 有 限公司）；色譜 甲 醇（天 津 四 友 精 細 化 工 公 司）；土 霉素（上海麥克林）。

１．２ 菌株

真菌Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓｌｕｎａｔｕｓ（ＴＡ２６－４６）分離 自 中國廣西潿洲島珊瑚礁的?？悠肪幪?ＧＸＷＺ－ ２６），根據形態、理化特征及分子生物學方法，鑒定 該 菌 株 為 Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓｌｕｎａｔｕｓ，Ｇｅｎｅｂａｎｋ 登 錄 號：ＪＮ９４３４６２，現保藏于中國海洋大學海洋藥物教 育部重點實驗室。－８０ ℃超低溫保存。

１．３ 培養基

（１）ＹＴＳ 液 體 培 養 基：海 鹽 ３３ｇ／Ｌ，葡 萄 糖 ２０ｇ／Ｌ。
（２）ＰＹＧ 液體 培 養 基：酵 母 膏１０ｇ／Ｌ，蛋 白胨１０ｇ／Ｌ，葡萄糖２０ｇ／Ｌ，海鹽３３ｇ／Ｌ。
（３）甘 油培養 基：甘 油 ２０ｇ／Ｌ，酵 母 膏 １０ｇ／Ｌ，蛋 白 胨 １０ｇ／Ｌ，海鹽３３ｇ／Ｌ。
（４）淀粉 培 養 基：可 溶 性 淀 粉１０ｇ／Ｌ，蛋白胨１０ｇ／Ｌ，海鹽３３ｇ／Ｌ。
（５）甘露 醇培養基：甘露醇２０ｇ／Ｌ，麥芽糖２０ｇ／Ｌ，葡萄糖 １０ｇ／Ｌ，谷氨酸鈉１０ｇ／Ｌ，酵母膏６ｇ／Ｌ，磷酸二氫 鉀０．５ｇ／Ｌ，硫酸 鎂（ＭｇＳＯ４ ·７Ｈ２Ｏ）０．３ｇ／Ｌ，海 鹽３３ｇ／Ｌ。（６）磷酸鹽培養基：酵母膏３．５ｇ／Ｌ，葡 萄 糖 ２０ ｇ／Ｌ，蛋 白 胨 ３．５ ｇ／Ｌ，磷 酸 氫 二 鈉 （Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）１．２ｇ／Ｌ，氯 化 銨 ５ｇ／Ｌ，海 鹽３３ｇ／Ｌ。
（７）合成培養基：葡萄糖２０ｇ／Ｌ，硫酸 銨２ｇ／Ｌ，磷 酸 二 氫 鉀 １ｇ／Ｌ，硫 酸 鎂 （ＭｇＳＯ４ · ７Ｈ２Ｏ）１ｇ／Ｌ，氯化 鈉１ｇ／Ｌ，碳 酸 鈣２ｇ／Ｌ，海 鹽 ３３ｇ／Ｌ。
（８）ＰＤＡ 培養 基：馬 鈴 薯２００ｇ／Ｌ，葡萄 糖２０ｇ／Ｌ，海鹽３３ｇ／Ｌ。
（９）察氏培養基：硝酸鈉 ３ｇ／Ｌ，磷酸氫二鉀１ｇ／Ｌ，硫酸鎂（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ） ０．５ｇ／Ｌ，氯化鉀０．５ｇ／Ｌ，硫酸亞鐵０．０１ｇ／Ｌ，蔗糖 ２０ｇ／Ｌ，瓊脂２０ｇ／Ｌ，海鹽３３ｇ／Ｌ。ＰＤＡ 斜面培養 基：馬鈴薯２００ｇ／Ｌ，葡萄糖２０ｇ／Ｌ，瓊脂２０ｇ／Ｌ，海鹽３３ｇ／Ｌ。

１．４ 土霉素生物轉化與產物分離

在無菌條件下，將菌株Ｃ．ｌｕｎａｔｕｓ（ＴＡ２６－４６） 在ＰＤＡ 斜面培養基中２８℃培養７ｄ。加入１０ｍＬ 無菌人工海 水，刮 下 斜 面 的 孢 子。固 體 培 養 基 平 板轉 化 時，在 每 個 平 板 中 加 入 ２００μＬ 濃 度 為 ２５ｍｇ／ｍＬ的土霉素 溶 液（使 用 丙 酮 溶 解）。待固 體培養基冷卻至４０ ℃時，向每個平板倒入２０ｍＬ 培養基，輕輕混勻。吸?。玻埃?mu;Ｌ 孢子液涂布至培 養基平板，２８ ℃靜置培養２１ｄ；發酵結束后，適量 的乙酸乙酯萃?。炒?，ＨＰＬＣ進行分析檢測。 土霉素的生物轉化產物大規模制備采用察氏 固體培養基，共８００個平板，２８ ℃靜置培養２１ｄ。 發酵結束后，用乙酸乙酯萃?。炒?，合并萃取液蒸 干得浸膏５．１ｇ。經硅 膠 柱 層 析 分 離（石 油 醚－乙 酸乙酯，體 積 濃 度 １０％ ～１００％），獲得 ３ 個 組 分 （Ｆｒ．１～Ｆｒ．３）。Ｆｒ．２經過半制備型 ＨＰＬＣ純化， 獲得化合物２（５．３ｍｇ）和３（３．８ｍｇ）。

１．５ 生物活性測試

采用微量稀釋法對化合物進行抗細菌活性 測試。測試菌株包括：大腸桿菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、 白色葡萄球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｌｂｕｓ、金黃色葡萄 球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ 和銅 綠 假 單 胞 菌（綠 膿桿菌）Ｐｓｍｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ。環丙沙星為陽 性對照，ＤＭＳＯ 為陰性對照，細菌培養基為空白對照。２８ ℃恒溫培養２４ｈ，使用酶標儀測試６２０ｎｍ 波長處 的 吸 光 度，獲 得 化 合 物 的 最 小 抑 菌 濃 度 （ＭＩＣ）。

２ 結果與討論

用９種不同的培養基對Ｃ．ｌｕｎａｔｕｓ（ＴＡ２６－４６） 進行土 霉 素 轉 化 條 件 篩 選。ＨＰＬＣ 的 分 析 條 件： ＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８柱，流動相為甲醇（Ｂ）－水（Ａ），梯度 洗 脫：０～５ｍｉｎ，５％ Ｂ；５～１５ｍｉｎ，５％～２０％ Ｂ；１５～ ３０ｍｉｎ，２０％～３０％ Ｂ；３０～３５ｍｉｎ，３０％～１００％ Ｂ； ３５～６０ｍｉｎ，１００％ Ｂ。流速為２ｍＬ／ｍｉｎ；檢測波長 ２１０ｎｍ；進樣量２０μＬ。ＨＰＬＣ指紋譜圖分析表明， 在察氏固體培養基（Ｓ１０）中獲得了較好的轉化效果 （見圖１）。


３ 結論

本研究利 用 海 洋 真 菌 Ｃ．ｌｕｎａｔｕｓ（ＴＡ２６－４６） 成功地對土霉 素 進 行 了 生 物 轉 化，獲 得 了２個 未顯示抗菌活性的降解產物，表明海洋來源真菌Ｃ． ｌｕｎａｔｕｓ可有效降解四環素類抗生素土霉素，為環 境中土霉素的生物降解研究提供了參考資料。

 

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