長尾倉鼠SSR位點的篩選與擴增-水浴鍋使用

1991 年，MOORE 等提出了微衛星 DNA（Microsatellite DNA）的概念，即 SSR（Simple Sequence Repeats）位點，是一類由 1～6 個核苷酸為重復單位 組成的長達 200～800 bp 的核苷酸串聯重復序列。 微衛星位點中大量重復的部分很可能存在變異，變 異會表現為數目的整倍性不同或序列的不完全相 同，因而造成位點的多態性。而揭示這些變異，進而 發現不同的 SSR 在不同的種甚至不同個體間的多 態性，是 SSR 標記技術的目的。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 動物材料

在野外捕獲活體長尾倉鼠后，取 其尾尖為 DNA 提取材料。捕獲地及數量見表 1。

1.1.2 試劑

血液 / 細胞 / 組織基因組 DNA 提取 試劑盒 （天根生化科技有限公司），2×Taq PCR MasterMix 酶（天根生化科技有限公司），ddH2O，瓊 脂糖，1×TAE，30%聚丙烯酰胺（生工生物工程股份 有限公司），5×TBE，過硫酸銨，TEMED，GeStain 染 液（全式金有限公司），NaCl。

1.1.3 儀器

電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；微型高速離心機 Centrifuge 5424 （北京伯樂生命科學發展有限公司）；瓊脂糖凝膠電 泳槽（北京六一儀器廠）；聚丙烯酰胺凝膠電泳槽（北 京六一儀器廠）；凝膠成像系統（Alphalmager HP）； G1000 基因擴增儀（杭州博日科技有限公司）；DNA 定量儀 NANODROP 2000（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計與合成

試驗所采用的引物借鑒 了與長尾倉鼠同屬的黑線倉鼠 SSR 位點引物， 并由生工生物工程股份有限公司合成。具體序列以 及特點列于表 2。

1.2.2 長尾倉鼠基因組DNA的提取

采集長尾倉鼠尾尖作為 DNA 提取材料，用 DNA 提取試劑盒提取基因組 DNA。采用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測有目 標條帶后，對其進行定量分析。

2 結果與分析

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 含量和質量， DNA 提取結果經瓊脂糖凝膠電泳鑒定觀察結果如 圖 1 所示，質量較好。經 DNA 定量分析，其濃度平 均達到 1.8 ng/μL，表明濃度足夠，符合進行 SSR 位 點擴增的試驗要求。應用與長尾倉鼠同屬的黑線倉鼠 SSR 引物擴 增后的電泳結果顯示，引物 SSRf6 的擴增結 果（F）不明顯，長尾倉鼠很可能不存在這一位點，其 他 5 個位點表現的多態性都較好。

3 討論

非變性聚丙烯酰胺凝膠具有很高的分辨力，能 很好地分離小片段 DNA（5～500 bp），甚至可以分 離相差 1 bp 或分離單堿基突變所引起的不同片 段。但不同濃度會影響擴增條帶的清晰度。本研究 為了確定分離片段所需最適聚丙烯酰胺的濃度進 行了預試驗，分別測試了 8％，10％，12％的聚丙烯 酰胺凝膠，從預試驗結果來看，8％的聚丙烯酰胺 凝膠帶型最整齊且雜帶少，便于觀察分析試驗結果。