服務熱線：1751168309217511683092
服務熱線：1751168309217511683092
茶是由茶樹的嫩莖、葉加工而成，茶飲料具有 獨特風味和品質，以及抗衰老、抑菌、降 血 脂、減 肥等功效，是世界上除水之外消費最多的飲品。 一般將茶葉分為黑茶、紅茶、白茶、綠茶、烏 龍 茶 和黃茶等６大基本茶類，其中黑茶是我國獨具特色 茶類之一。普遍認為黑茶分為陜西茯磚 茶、廣 西 六堡茶、湖南安華黑茶和普洱茶等，但也有人將云 南普洱茶定義為后發酵茶，屬獨特種類。黑茶與后 發酵茶的加工均需要多種微生物的參與，以真菌為 主要發酵菌；茯磚茶的加工過程包括篩分、拼配、 汽蒸、渥堆、筑制、發花、干燥和 成 品 包 裝 等，經 過復雜工藝制成產品；普洱茶的發酵過程包括養 地、潮水、翻堆、降 堆、干 燥、渥 香、攤 涼 去 火 等 工藝流程加工而成；六堡茶的加工過程主要包括采 葉、攤晾、殺青、揉捻、渥堆、復揉、烘干、篩分、 蒸壓、陳化、出倉等流程。鑒于后發酵茶產地不同， 加工工藝不同，不同產地的主要微生物菌群也不相 同，而這些微生物菌群則影響著發酵后茶葉的風味 與品質。
１ 材料與方法
１．１ 供試茶葉
云南普洱茶、廣州小青柑、廣西六 堡茶、湖南熙茯茶。
１．２ 主要試劑
蛋白酶 Ｋ 購自 ＭｅｒｃｋＫＧａＡ 公司， 瓊脂糖購自法國 ＢＩＯＷＥＳＴ 公司，ＧｏｌｄｖｉｅｗⅡ購自 上海翊圣生物科技有限公司，氯仿購自北京化工廠， 瓊脂、Ｔｒｉｓ平 衡 酚、ＴｒｉｓＢａｓｅ （三 羥 甲 基 氨 基 甲 烷）、ＥＤＴＡ （乙二胺四乙酸）、ＳＤＳ （十二烷基硫酸 鈉）、氯霉素、虎紅鈉鹽、酪蛋白、臺盼藍和剛果紅購自北京索來寶科技有限公司，氯化鈉 （分析純）、 無水乙醇 （分析純）、葡 萄 糖 （分 析 純）、可 溶 性 淀 粉和溴甲酚紫購自天津市凱通化學試劑有限公司， 羧甲基纖維素鈉購自青州市清泉纖維素廠，橄欖油 購自遼寧晟麥實業股份有限公司，聚乙烯醇購自上 海源葉生物科技有限公司。用于真菌分子鑒定的擴 增引物由華大基因合成，引物序列為ＩＴＳ１ （５′－ＴＣ－ ＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３′）和ＩＴＳ４ （５′－ＴＣＣ－ ＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３′）。
１．３ 主要儀器
生物安全柜，蘇州安泰空氣技術有 限公司；光照培養箱，上海新苗醫療器械制造有限 公司；ＰＣＲ 擴 增 儀，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公 司；水 平電泳槽，北京君意東方電泳設備有限公司；培清 ＪＳ－６８０ＤＪ全自動凝膠成像分析儀，上海培清科技有 限公司；ＹＸＱ－ＬＳ－立式壓力 蒸 汽 滅 菌 器，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；高精度數顯恒溫水浴鍋， 常州智博瑞儀器制造有限公司；ＨＮＹ－２１０２Ｃ 搖床， 天津市歐諾儀器儀表有限公司。
１．４ 實驗方法
１．４．１ 培養基 （液）的配制
孟加拉紅培養基：蛋 白胨５ｇ，葡 萄 糖 １０ｇ，磷 酸 二 氫 鉀 １ｇ，硫 酸 鎂 ０．５ｇ，瓊脂２０ｇ，１／３０００ 孟 加 拉 紅 溶 液 １００ ｍＬ， 氯霉 素 ０．５ ｇ， 加 入 ｄｄＨ２Ｏ 定 容 至 １０００ ｍＬ， １２１ ℃高壓滅菌２０ｍｉｎ，備用。ＰＤＡ 培養基：稱取 新鮮馬鈴薯２００ｇ，加熱煮沸，煮至土豆軟，過濾取 濾液，加入葡萄糖２０ｇ，瓊脂２０ｇ，加入ｄｄＨ２Ｏ 定 容至 １０００ ｍＬ，１２１ ℃ 高 壓 滅 菌 ２０ ｍｉｎ，備 用。 ＰＤＡ 培養 液：稱 取 新 鮮 馬 鈴 薯 ２００ｇ，加 熱 煮 沸， 煮 至 土 豆 軟， 過 濾 取 濾 液， 葡 萄 糖 ２０ ｇ， 加 入 ｄｄＨ２Ｏ 定容至１０００ｍＬ，?。保埃埃恚倘瞧窟M行分 裝，１２１ ℃高壓滅菌２０ｍｉｎ，備用。產淀 粉 篩 選 培 養基 （２００ ｍＬ 溶 液）： 在 ＮＡ 培 養 基 的 基 礎 上，加入０．４ｇ 可 溶 性 淀 粉 和 ０．００５％ 的 臺 盼 藍，加 入 ｄｄＨ２Ｏ 定 容 至 ２００ ｍＬ，加 入 ＮａＯＨ 調 節 ｐＨ 至 ７．０～７．５，１２１ ℃高 壓 滅 菌２０ｍｉｎ后 冷 卻 至６０ ℃ 左右，在超凈工作臺中，分裝至直徑９ｃｍ 的無菌培 養皿中，冷卻凝固后４ ℃貯存，備用。產蛋白酶篩 選培養基 （２００ ｍＬ 溶 液）：稱 取 酪 蛋 白 ４ｇ，瓊 脂 ３．４ｇ，加入ｄｄＨ２Ｏ 定容至２００ｍＬ，加入 ＮａＯＨ 調 節ｐＨ 至７．０～７．５，１２１ ℃高壓滅菌２０ｍｉｎ后冷卻 至６０ ℃左右，在超 凈 工 作 臺 中，分 裝 到 直 徑９ｃｍ 的無菌培養皿中，冷卻凝固后４ ℃貯存，備用。產 纖維素酶篩選培養基 （２００ｍＬ 溶液）：稱取羧甲基 纖維素鈉１．０ｇ，硫酸銨０．４ｇ，磷酸二氫鈉０．２ｇ， 硝酸鉀０．２ｇ，酵母膏０．１ｇ，七水合硫酸鎂０．１ｇ， 蛋白胨 ０．１ｇ，ＮａＣｌ０．１ｇ，剛 果 紅 ０．０４ｇ，加 入 ｄｄＨ２Ｏ 定 容 至 ２００ ｍＬ，加 入 ＮａＯＨ 調 節 ｐＨ 至 ７．０～７．５，１２１ ℃高 壓 滅 菌２０ｍｉｎ后 冷 卻 至６０ ℃ 左右，在超凈工作臺中，分裝到直徑９ｃｍ 的無菌培 養皿中，冷卻凝固后４ ℃貯存，備用。產脂肪酶篩 選培 養 基 （２００ ｍＬ 溶 液）：在 ＮＡ 培 養 基 中 加 入 １２％橄欖油乳化液、０．００５％溴甲酚紫，調節ｐＨ 至 ８．０，１２１ ℃高壓滅菌２０ｍｉｎ后冷 卻 至６０ ℃左 右， 在超凈工作臺中，分裝到直徑９ｃｍ 的無菌培養皿中， 冷卻凝固后４ ℃貯存，備用。橄欖油乳化液的配制： 橄欖油和０．０２ｇ／ｍＬ的聚乙烯醇 （ＰＶＡ）以 體 積 比 １∶３混合，６０Ｈｚ震蕩混勻５～１０ｍｉｎ，得乳化液。
１．４．２ 真 菌 ＤＮＡ 提 取 液 的 配 制
１ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ ＨＣｌ （ｐＨ＝８．０）１０ｍＬ，０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ （ｐＨ＝ ８．０）２０ ｍＬ，２０％ ＳＤＳ ２０ ｍＬ，５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ ２０ｍＬ，ｄｄＨ２Ｏ 定 容 至 ２００ ｍＬ，調 節 ｐＨ 至 ８．０， １２１ ℃高壓滅菌２０ｍｉｎ后，常溫貯存。
２ 結 果
真菌在 ＰＤＡ 培 養基上進行培養，直至分純。在云南普洱茶中分離 出２種 真 菌，Ｐ１ 為 籃 狀 菌 屬 （Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｓｐ．）， Ｐ２為 籃 狀 菌 （Ｔ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）；在 廣 州 小 青 柑 中 分 離出３ 種 真 菌，Ｑ１ 為 阿 曲 霉 （Ａ．ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ）， Ｑ２為煙 曲 霉 （Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ），Ｑ３ 為 繩 狀 籃 狀 菌 （Ｔ．ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｓ）；在 廣 西 六 堡 茶 中 分 離 出 ２ 種 真 菌，Ｌ１為黑曲霉 （Ａ．ｎｉｇｅｒ），Ｌ２為冠突曲霉 （Ａ． ｃｒｉｓｔａｔｕｓ）；在湖南 熙 茯 茶 中 分 離 出 １ 種 真 菌，Ｘ１ 為謝瓦曲霉 （Ａ．ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）。其中，分 離 自 普 洱 茶 的 籃 狀 菌 屬 Ｔａｌａｒｏ－ ｍｙｃｅｓ．ｓｐ．產纖維酶活性能力最強，分離自 小 青 柑 的繩狀籃狀菌的產纖維酶活性能力次之 。 ２．４．３ 發酵茶中真菌產淀粉酶活性比較 在發酵茶 分離得到的真菌中產淀粉酶共５種，分別為普洱茶 中分 離 到 的 Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｓｐ．和 Ｔ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ，小 青柑中分離到的煙曲霉和繩狀籃狀菌以及六堡茶中 分離到的冠突曲霉，統計學分析表明，不同真菌的 產淀粉酶活性差異有統計學意義 （Ｆ＝３６．６０２，Ｐ＜ ０．０１）。其 中，普 洱 茶 中 分 離 到 的 籃 狀 菌 Ｔａｌａｒｏ－ ｍｙｃｅｓｓｐ．和小青柑中分離到的繩狀籃狀菌產淀粉酶 能力最強，普洱茶中分離到的 Ｔ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ產淀粉 酶活性能力次之，六堡茶中分離到的冠突曲霉產淀 粉酶能力最差。
３ 討 論
所用茶葉 中，普洱茶和小青柑屬普洱茶系，六堡茶和茯磚茶 屬黑茶系，但均可歸屬于后發酵茶。已有研究表明， 后發酵茶中的優勢菌群為真菌，而又以曲霉屬、酵 母、青霉屬、根霉、毛霉屬和冠突散囊菌等為主， 不同茶葉發酵工藝中的真菌菌群，可能是影響發酵 茶口感和品質的主要因素。普洱茶、六堡茶和茯磚 茶是發酵茶的典型代表，而在不同茶葉的發酵過 程中，其優勢微生物菌群也有不同，參與普洱茶發 酵的微生物主要以黑曲霉 為 主， 還 包 括 酵 母 （Ｙｅａｓｔ）、 青 霉 屬 （Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、 根 霉 （Ｒｈｉｚｏ－ ｐｕｓ）、毛 霉 屬 （Ｍｕｃｏｒ）等 真 菌；茯 磚 茶 中 優 勢 菌群主要以冠突散 囊 菌 （Ｅｕｒｏｔｉｕｍｃｒｉｓｔａｔｕｍ） 為 主；六堡茶 中 優 勢 菌 群 為 青 霉 屬 和 曲 霉 屬 真 菌； 其他發酵茶的優勢微生物以曲霉屬和散囊菌屬等真 菌為主。涇 陽 茯 磚 茶 中 的 優 勢 菌 種 為 冠 突 散 囊 菌，其發酵液具有抗氧化活性，且以產總超氧化物 歧化酶 Ｔ－ＳＯＤ 為 主。茶葉中的真菌在發酵過程 中，還可以茶葉為基質產生多酚氧化酶、單寧酶和 纖維素酶等多種酶類。然而，不同發酵茶的 優 勢真菌比較及其在發酵過程中是否有產消化酶活性 的研究尚未見報道。
