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貝萊斯芽孢桿菌( Bacillus velezensis) Tu － 569 發 酵產生的胞外抗菌肽可抑制大腸桿菌、沙門氏桿菌、 痢疾桿菌等致腹瀉病原菌的生長，且耐受胃腸道環 境、耐熱性好，在畜牧養殖業極具應用潛力。T － 70－1 菌株是由 Tu－569 菌株經紫外－微波誘變獲得 的菌株，其產抗菌肽能力是原菌株的 2. 74 倍。
1 材料
1. 1 菌株
貝萊斯芽孢桿菌( Bacillus velezensis) T－70－1、大腸桿菌( E． coli) ATCC 53832，均由河北農業大學制藥 工程系實驗室保存。
1. 2 主要試劑
牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉，均購自北 京奧博星生物技術有限公司; 葡萄糖、NaCl、MgSO4 · 7H2O、KCl、NaH2PO4 ·2H2O、Na2HPO4 ·2H2O 等，均購 自天津市永大化學試劑有限公司; 消泡劑，購自佛山 市南海大田化學有限公司; NB 培養基、NA 培養基、 LB 培 養 基、LA 培 養 基、發 酵 培 養 基 ( 葡 萄 糖 25. 0 g，蛋 白 胨 20. 0 g，MgSO4·7H2O 0. 8 g，KCl 1. 0 g，NaH2PO4 ·2H2O 2. 0 g，Na2HPO4 ·2H2O 4. 0 g， 水 1 000 mL，初始 pH 值為 6. 5) ，均自制。
1. 3 主要儀器
立式壓力蒸氣滅菌鍋( YXQ－LS－100G 型) ，購自 上海博訊有限公司; 高速落地離心機( Sorvall·lynx· 6000 型) ，購自賽默飛世爾科技有限公司; 5 L 離位滅 菌玻璃發酵罐( BLBIO－ 5GJ 型) 、30 L 自動發酵罐 ( 30SJ 型) ，均購自上海百侖生物科技有限公司; 發電 機( W120 型) ，購自上海復宏機電有限公司; 溶氧電 極( OXYFEＲM FDA VP 225 型) 、pH 電極( EasyFerm Plus PHI K8 225 型) ，均購自天津恩耐德科技有限公 司; 低溫恒溫攪拌反應浴( DHJF－4020 型) ，購自鄭州 長城科工貿有限公司; 全無油空氣壓縮機( VWYD－ 20 /0－8 型) ，購自鞍山佳朋壓縮機有限公司; 儲氣罐 ( DY02－13－14H－00 型) ，購自上海東亞壓力容器制造有限公司; 全自動電加熱蒸氣發生器( YN30－0. 7－ D 型) ，購自上海揚諾鍋爐制造有限公司。
2 方法
改良二倍稀釋法測 定抗菌肽效價，即離心取發酵上清液作為抗菌肽樣 液，用無菌生理鹽水進行逐步二倍稀釋，以大腸桿菌 ATCC 53832 作為指示菌，采用瓊脂擴散法測定各 個稀釋倍數下抗菌肽發酵樣液對大腸桿菌的抗菌特 性。各個稀釋倍數下的抗菌肽發酵液樣品中以出現 肉眼不可見抑菌圈為終點。原液抗菌肽效價( 單位 為 Au) = 2n×1 000 /40，其中 n 表示不出現可見抑菌 圈的二倍稀釋次數，40 表示孔中加液體積( μL) 。建 立抗菌肽抗菌效價和抑菌圈面積之間的線性關系，最 后繪制出效價測定標準曲線。將發酵罐清洗干凈后裝入 發酵培養基，蓋上上蓋，裝上 pH 電極和溶氧電極，夾 緊通氣管路、進出水管路，并用錫紙包裹 pH 電極、溶 氧電極、消泡電極、攪拌器的頂部。檢查完畢后，放入 滅菌鍋中 115 ℃滅菌 30 min。滅菌完畢后取出發酵罐，連 接好冷卻水管( 兩進兩出) 、出氣管、進氣管; 組裝上 攪拌電機，插上消泡電極、溫度電極、pH 電極和溶氧 電極; 連接好消泡劑補加管路
3 結果與分析
發酵上清液抗菌肽效價對數值和抑 菌圈面積呈現出良好的線性關系，其中 Ｒ2 = 0. 996 5， 曲線方程為: y = 0. 004 7x+1. 600 1，其中 x 為抑菌圈 面積( mm2 ) ，y 為效價對數值。若效價超過計算范圍 則需要將樣品進行稀釋后測定。此方法操作簡單、工 作量小、準確度高、便于批量檢測。在 5 L 發酵罐最優發酵條件下，即發酵罐內發酵 液體積為 2. 0 L，發酵通氣率( 即單位體積發酵液所 對應的通氣量) 為 1. 00 L /( min·L) ，放大到 30 L 發 酵罐時，若其中發酵液體積為 20 L，則依據發酵通氣 率不變，其通氣量應為 20. 0 L /min，即1. 2 m3 / h。故 設定 30 L 發酵罐裝液體積為 20 L，通 氣 量 為 1. 2 m3 / h，攪拌速度為 180 r /min，罐壓為 0. 05 MPa。0 ～ 12 h，隨著發酵時間的推移，pH 值逐漸降低， 第 12 小時時達到最低值，為 5. 50。這個階段菌體快 速繁殖生長，需氧量增加，pH 值降低; 隨后 pH 值逐漸升高，菌群生長趨于穩定。
4 討論與結論
采用 二 倍 稀 釋 法 探 究 B． laterosporus S62－9 的胞外抗菌肽對 S．aureus 的抑制效果，發現抗 菌肽發酵樣品的發酵對數值與抑菌圈直徑存在線性 關系，其抗菌效價最高可達 8 000 Au。本試驗中 T－ 70－1 菌株胞外抗菌肽的效價對數值與抑菌圈面積之 間存在線性關系，確定了原發酵液抗菌肽的效價，這 種方法既避免了人為主觀影響，又解決了抗菌肽沒有 標準品的難題。
