白血病細胞的生物學效應影響-博迅超凈工作臺使

急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）是一種惡性血液系統腫瘤疾病， 也是兒童時期最常見的惡性腫瘤，占兒童惡性腫 瘤的 35%。ALL 的臨床癥狀主要表現為貧血、肝 脾腫大及免疫能力低下，對患者健康危害嚴重 。 ALL 的發病機理較為復雜，對其機理目前尚未完 全明確。microRNA 是一類存在于真核細胞中的 非編碼小 RNA 分子，可特異性的抑制某些 mRNA 的表達，從而對細胞的生長、凋亡等重要生理活 動產生作用 。

材料和方法

試劑及儀器

TRIzol 試劑購自美國 Invitrogen 公司；胎牛血清購 自美國 Hyclone 公司；ECL 試劑盒購自武漢艾美 捷科技有限公司；增殖細胞核抗原（PCNA）、 Caspase 3、Cyclin D1 及 MMP-9抗體均購自美國 Cell Signaling 公司；PVDF 膜購自美國密理博公司； 雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶 科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自上 海威奧生物科技有限公司；FACSCanto 流式細胞儀 購自美國 BD 公司；DYCZ-24A 型雙垂直電泳儀購自北京六一儀器廠；PCR 系統購自瑞士 Roche 公 司；超凈工作臺購自上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；CO2 細胞培養箱購自上海精密儀器儀表 有限公司。 臨床標本采集 2018 年 5 月至 2018 年 11 月在本院確診的 ALL 患 兒 23 例，其中男 14 例，女 9 例，年齡 8.9 ±2.3 歲， 參照張之南主編《血液病診斷及療效標準》進行 診斷?；純杭覍倬炇鹬橥鈺?，且本研究經 醫院倫理委員會批準?；純旱墓撬铇颖揪谥委?前采集，以防止藥物對骨髓樣本的干擾。采集患 兒骨髓樣本 2 m1 后，置于含 K2EDTA 的抗凝管中， 加入 Ficoll 分離液進行密度梯度離心，以提取骨髓 單個核細胞（BMNC），置于液氮保存。 細胞培養及轉染 采用含 10% 胎牛血清、5 μg/ml 青鏈霉素的 RPMI 1640 培養液，置于 37 ℃、5% CO2 的保溫箱培養， 每 2-3 d 傳代 1 次。細胞轉染步驟：將 BMNC 接種 至 24 孔 板， 分 為 對 照 組（Control 組），miR-221 陰 性 對 照 組（miR-221-NC 組）及 miR-221 轉 染 組（miR-221 組），待細胞培養至對數期，按照 Lipofectamine 2000 試劑盒說明書進行轉染操作， 并于 37 ℃、5% CO2 條件下培養。 ALL 細胞 miR-221 水平的 RT-PCR 檢測 各組細胞轉染后培養 24 h，采用 TRIzol 試劑盒提 取細胞總 RNA，檢測 RNA 純度后，通過逆轉錄試 劑盒合成 cDNA。按照 miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒說明書檢測 miR-543 水平，以 U6 為內參，miR221 上 游 引 物：5′-CTGACTGCGTCACTGC-3′； 下 游 引 物：5′-CTGACGTGCAGTGCAC-3′。U6上游 引物：5′-GCGTACTGCGTGCATC-3′；下游引物： 5′-GACACTGCAGTCACTC-3′。PCR 反應步驟為： 95 ℃ 2 min；然后 95 ℃ 30 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s， 共 32 個循環，采用 2- △△ Ct 法計算基因的相對水平。

結 果

轉染后各組 ALL細胞的 miR-221水平 miR-221 組的 miR-221 的表達水平顯著高于對照組 及 miR-221-NC 組（P＜ 0.05）（圖 1）。

轉染后 ALL 細胞增殖水平的變化 轉染 2、3、4 和 5 d 后，miR-221 組 BMNC 細胞增 殖水平顯著低于對照組及miR-221-NC組（P＜ 0.05） （圖 2）。

討 論

ALL 是兒童時期較為常見的血液疾病，臨床癥狀 主要表現為免疫功能減弱、貧血、發熱及血小板 數量下降等 。在 ALL 治療過程中，由于需要長期的化療干預，往往會產生不良反應，對患兒健 康及生活也產生嚴重危害，有臨床研究發現，兒 童急性淋巴細胞白血病治愈率較低，且容易復發， 嚴重影響治療效果 。乳腺癌患者 的腫瘤組織中 miR-221 水平顯著下降，這與患者預 后密切相關。miR-221 在肺癌、肝癌等多種癌細 胞中表達水平顯著下降，通過上調細胞中 miR-221 水平，可抑制癌細胞增殖及遷移。因此，需 進一步分析 miR-221 對 ALL 細胞抑制效果，以期 為提高患兒治療效果提供實驗參考。