脊髓損傷大鼠神經功能修復的影響分析

脊髓損傷（ｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙ，ＳＣＩ）具有致殘率 高、后期康復及生活負擔重等特點，骨髓間充質干細 胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）作為種子細胞 定向移植可 促 進 ＳＣＩ修 復 及 功 能 恢 復 已 得 到 廣 泛 的證實。但是，ＢＭＳＣｓ定向移植后因細胞生長環 境改變、脊髓原發性損傷炎性反應以及脊髓損傷后 相關抑制性信號通路開放所致繼發性損傷導致移植 細胞出現凋亡、生長緩慢、分化抑制等難題。相 關文獻認為繼發性損傷所導致的病理生理變化對神 經功能恢復起決定性作用，而相關抑制性信號通路 開放所致趨 化 因 子 和 細 胞 因 子 的 活 化 正 是 ＳＣＩ后招募、激活炎性細胞的扳機點，從而進一步加重 ＳＣＩ 的繼發性損 傷。

１ 材料與方法

１．１ 實驗動物及分組

選 ?。抵?周 齡 為３～４周、 體質量為１００ｇ健 康 雄 性 ＳＤ 大 鼠 用 于 ＢＭＳＣｓ的 提取，選?。福爸恢荦g為８周、體質量３００ｇ雄性ＳＤ 大鼠用于制作模型。ＳＤ大鼠均為清潔級，由新疆醫 科大學動物飼養中心提供，本研究經新疆醫科大學 第一 附 屬 醫 院 動 物倫理委員會批準 （編 號： ＩＡＣＵＣ２０１６１２０８－０５）。將８０只 大 鼠 根 據 不 同 實 驗 干預措 施 隨 機 分 為 ＳＣＩ模 型 組、ＢＭＳＣｓ移 植 組、 Ｆａｓｄｉｕａｌ治療組、聯合治療組（２０只／組）。

１．２ 試劑及儀器設備

胎牛血清、低糖 ＤＭＥＭ 培 養基、ＰＢＳ緩沖液、雙抗、０．５％胰蛋白酶（美國 Ｈｙ－ ｃｌｏｎｅ公司）；神經元性特異性烯醇化酶（ＮＳＥ）抗體、 膠質纖維酸性蛋白（ＧＦＡＰ）抗體及四甲基異硫氰酸 羅丹明（ＴＲＩＴＣ）標記的羊抗兔ＩｇＧ 抗體、二脒基苯 基吲哚（ＤＡＰＩ）復染液（武漢博士德公司），神經絲蛋 白（ＮＦ２００）抗 體（北 京 博 奧 森 公 司）。超 凈 工 作 臺 （蘇凈安泰），高速離心機（美國 Ｔｈｅｒｍｏ公司）倒 置 相差顯微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ），恒溫培養箱（上海博迅醫療股份有限公司），圖像采集設備（ｆｅｃｉａＤＭ３０００）。

１．３ ＢＭＳＣｓ的提取、培養、純化及鑒定

無菌條件 下取出５只周齡３～４周、體質量為１００ｇ大鼠的雙 側股骨及脛骨，置 于５％雙 抗 的 ＤＭＥＭ 中，用 低 糖 ＤＭＥＭ 反復沖洗骨髓腔，反 復 吹 打 成 單 細 胞 懸 液， 清洗、離心細 胞２ 次 去 除 肉 眼 可 見 的 雜 質 及 油 脂。 用含體積分數１２％胎牛血清的 ＤＭＥＭ 制作單細胞 懸液接種于 培 養 瓶 中，置 于３７℃、５％ ＣＯ２ 恒 溫 培 養箱中培 養，７２ｈ 首次換液棄去未貼壁的 懸浮細 胞，之 后 每 ３ 天 換 一 次 液，當 細 胞 生 長 至 ８０％ ～ ９０％時，進行胰酶消化傳代（１∶３傳代），第３代 細 胞已經去除非貼壁的骨髓造血干細胞，得到純化的 ＢＭＳＣｓ，使用流式細胞計數進行檢測。移植前用毛 細吸管反復吹打分離細胞，制作單細胞懸液，ＰＢＳ洗 滌２次，調整細胞密度為１×１０６ 個／μＬ，移植備用。

１．４ ＳＣＩ大鼠模型制作

?。樱拇笫笥茫保埃ニ下?醛腹腔注射 麻 醉（３００ ｍｇ／ｋｇ）后，麻 醉 生 效 后 固 定 于解剖板上備皮消毒，以胸１０為中心做５ｃｍ 長切 口，逐層分離暴露胸９、１０、１１棘突和椎板，咬除棘突 及椎板充分暴露脊髓。根據改良 Ａｌｌｅｎ法用５ｇ砝 碼從１６ｃｍ 高度通過適當粗細的玻璃試管自由下 落，砝碼柄端朝下，打擊面積約３．０ｍｍ２。砝碼自由 落下打擊到脊髓時大鼠迅速出現雙下肢回縮撲動及 擺尾動作，隨后出現遲緩性癱瘓，迅速移除砝碼后可 見脊髓充血 水 腫，提 示 ＳＣＩ模 型 制 作 成 功，生 理 鹽 水沖洗后逐層關閉切口。術后膀胱按摩３～５次／ｄ， 促進反射性排尿至恢復正常排尿，２０萬 Ｕ／ｋｇ青霉 素皮下注射３～５ｄ預防切口及泌尿系感染。

１．５ 干預方法

ＳＣＩ模型組：脊髓損傷模型制作成 功后 逐 層 關 閉 切 口，３０ ｍｉｎ 后 腹 腔 注 射 １ ｍＬ 的 ０．９％氯化鈉注射液。ＢＭＳＣｓ移植組：脊髓損傷模型 制作成功后３０ｍｉｎ腹腔注射１ｍＬ的０．９％氯化鈉注 射液，術后５ｄ沿原切口切開暴露脊髓損傷節段，硬 膜下注射１０μＬ的１×１０６／μＬ骨髓間充質干細胞單 細胞懸液。Ｆａｓｄｉｕａｌ治療組：脊髓損傷模型制作成功 后３０ｍｉｎ腹腔注射１ｍＬ的Ｆａｓｄｉｕａｌ（０．８５ｍｇ／ｋｇ）， 術后５ｄ沿原切口切開暴 露 脊 髓 損 傷 節 段，硬 膜 下 注射１０μＬ０．９％氯化鈉注射液。聯合治療組：脊髓 損傷模型制作成功后 ３０ ｍｉｎ 腹 腔 注 射１ｍＬ Ｆａｓｄｉｕａｌ（０．８５ｍｇ／ｋｇ），術后５ｄ天沿原切口切開暴 露脊髓損傷節段，硬膜下注射１０μＬ１×１０６ 個／μＬ骨 髓間充質干細胞單細胞懸液。

１．６ 運動功能評分

由 本 課 題 組２名 研 究 人 員 采 用 ＢＢＢ（ｂａｓｓｏ－ｂｅａｔｔｉｅ－ｂｒｅｓｎａｈａｎ）評 分 法 分 別 于 ＳＣＩ術后第１、７、１４、２１、２８天同一時間段對各組大鼠 后肢運動功能進行評分，評分范圍０～２１分，０分為無 后肢運動，２１分為后肢正常運動，評分取平均值。

１．７ 組織學觀察

ＳＣＩ術后第２８天各組大鼠腹腔 注射１０％水合氯醛，麻醉處死各 組 ＳＣＩ大 鼠，按 原 切口進入，以損傷脊髓節段為中心切取約１ｃｍ 長度 完整脊髓組織，置于４％多聚甲醛固定４８ｈ，常規梯 度脫水、石蠟包埋。取蠟塊制片，厚度４μｍ，６０℃烤 箱烤片過夜備用。切片經脫蠟、脫水、透明后分別進 行 ＨＥ、免疫組 織 化 學、免 疫 熒 光 染 色，鏡 下 觀 察 脊 髓標 本 形 態 學 結 構 以 及 ＮＳＥ、ＮＦ２００、ＧＦＡＰ 的 表達。

１．８ 免疫組織化

學 半 定 量 分 析 采 用Ｉｍａｇｅ－Ｒｒｏ－ Ｐｌｕｓ圖像分析軟件對免疫組織化學染色結果進行 分析，根據陽性染色細胞及染色強度計算出光密度 值，用于后續統計分析。

１．９ 統計學處理

數據采 用 ＳＰＳＳ１７．０軟 件 進 行 統計分析，服從正態分布的計量資料以均數±標準 差 （ｘ－ ±ｓ）表示，組間比較采用方差分析，組間兩兩 比較 采 用 ＳＮＫ－ｑ，以 Ｐ ＜０．０５ 為差異有統計學 意義。

２ 結果

初次換液后原代細胞呈集 落分布于培養瓶，經傳代后均勻生長，３代細胞均勻 分布，細胞呈梭形。３代細胞表型 ＣＤ２９、ＣＤ４５的陽 性率分別為８２．４％、２．０％，見圖１。


各 組 ＳＣＩ大 鼠 術 后１ｄ評 分 均 位 于較低水平，運動范圍為無運動到１～２個關節的輕 微運動，術后１～２８ｄ各組 ＳＣＩ大鼠運動功能均有 改善，以術后１４～２８ｄ改 善 幅 度 相 對 較 大，以 聯 合治療組運動改善效果最佳，聯合治療組在損傷第１４ 天開始ＳＣＩ大鼠 ＢＢＢ評分逐漸優于其余治療組，且 差異有統計學意義 （Ｐ ＜０．０５），見表１。ＳＣＩ術后第２８天觀察各組標本 ＨＥ 結果顯示聯合治療組脊髓傷修復效果明顯，脊髓空洞面積最 小，其 次 為 ＢＭＳＣｓ移 植 組 和 Ｆａｓｄｉｕａｌ治 療組，而ＳＣＩ模 型 組 空 洞 面 積 最 大，損 傷 組 織 的 修 復效果較差，見圖２。ＢＭＳＣｓ移植組、Ｆａｓｄｉｕａｌ治療 組和聯合治 療 組 分 別 與 ＳＣＩ模 型 組 相 比 差 異 均 有 統計學意義 （Ｐ ＜０．０５），見表２。

３ 討論

脊髓損傷（ＳＣＩ）由初始的原發性和漸進的繼發 性兩部分損傷共同所致。目前，因各種外傷 因 素 造成脊髓結構破壞的原發性損傷還無法可控，僅限 于手術解除壓迫為脊髓恢復創造有利條件；然而，以 脊髓水腫、炎癥反應、神經細胞凋亡、神經元不能再 生一系列聯動的繼發性損傷是可以干預的，也是當 前解決脊髓損傷再生修復的研究方向。脊髓損傷 后軸突再生和正確靶向是損傷后脊髓修復與功能重 建的難點，干細胞移植治療脊髓損傷能很好解決這一難題，其 中 的 ＢＭＳＣｓ定 向 分 化 移 植 是 最 具 應 用 前景之一。但 由 于 ＢＭＳＣｓ移 植 于 損 傷 脊 髓 后 會繼發性損傷出現移植細胞生存率下降、生長緩慢、 定向分化抑制等不利的方面。所以，本課題以此為 據點進行研究。