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醬油是以大豆（或豆粕）、小麥（或麩皮）為主 要原料，以米曲霉制曲，加食鹽發酵而成的一種 調味品。 早期，醬油生產以天然混菌發酵為主。 上 世紀 60～70 年代，為了提高氨態氮得率等指標，逐 步過渡到米曲霉純種發酵。 上世紀末，醬油企業為 了改善醬油的風味，又紛紛嘗試添加魯氏酵母菌、 球擬酵母和乳酸菌發酵來提高醬油品質。
1 材料與設備
1.1 材料與試劑
豆粕、麩皮、AS3.042 米曲霉，老恒河釀造有限 公司；AS2.180 魯氏酵母、 滬釀 2.14 球擬酵母、滬 釀 1.08 乳酸菌， 上海迪發有限公司； 氫氧化鈉， 天津市科密歐化學試劑開發中心；濃鹽酸（36%～ 38%），衢州恒化試劑有限公司；濃硫酸，衢州恒化 試劑有限公司； 葡萄糖， 廣東光華化學廠有限公 司；硫酸鉀，上海振新試劑廠；乙酸、3-甲基丁醛、 丁醇、乙酸乙酯、3-辛醇（內標），Alfa aecer 公司； 甲 醛（36%），杭州高晶精細化工有限公司；氯 化 鈉，天津市科密歐化學試劑開發中心。
1.2 儀器與設備
HH-4 數顯恒溫水浴鍋，上海博迅；8HW-1 型 恒溫磁力攪拌器，科大創新；pHS-3C 型酸度計，上海雷磁儀器廠；電子天平，上海精科；電子分析天 平，上海精科；721 可見分光光度計，上海精密科 學儀器有限公司；TN303-4 恒溫培養箱，南京市江 寧電器儀器廠；3-Octanol（內標），Alfa aecer 公司； 30 m ×0.25 mm ×0.25 μm 毛 細 管 色 譜 柱 ；75 μm Carboxen/PDMS 萃 取 頭 ；Agilient 5975C 氣 相 色 譜-質譜聯用儀，美國安捷倫公司；手動 SPME 進 樣器。
1.3 方法
以 6∶4（w/w）的比例把原料豆粕與麩 皮均勻混合。 然后經過潤水、蒸煮、冷卻三個步驟 后， 按接種量為 0.3%接種滬釀 3.042 米曲霉單菌 種制曲。 在 35～37 ℃下，制曲 46 h。 1.3.2 醬油發酵 設置 4 個組，Ⅰ組為對照組，其 余Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 3 組為試驗組。 每組稱取成曲 10 kg， 然后與濃度為 19 °Bé 的鹽水按照 1 ∶ 2 （曲 ∶ 鹽水 w/w）的比例混合，進行發酵，溫度為室溫。 按照 表 1 的試驗設計進行試驗。 發酵開始的當天設為 0 d 開始取樣，之后每隔 10 d 取樣一次，測定在不 同時間段醬油發酵過程中理化指標的變化。 到 90 d 結束取樣。
2 結果與討論
對醬油中的氨基酸態氮含量、 糖化酶含量、 pH 值、還原糖含量與發酵天數的關系用 Origin 8 軟件進行擬合， 可以得到醬油的理化指標與發酵 時間的函數。 醬油的 pH 等理化指標與發酵時間 的擬合曲線見圖 1～圖 3。
由圖 1 可知， 發酵 90 d， Ⅳ組添加了魯氏酵 母、 球擬酵母和乳酸菌制曲的醬油氨基酸態氮含 量最高，可達到 1.38 g/100 mL，Ⅰ組最低。 在發酵 過程中氨基酸態氮的含量趨勢呈現先增加后平 穩。 在 50 d 以前，對照組高于試驗組，50 d 后對照 組中的氨基酸態氮含量基本趨于平穩。 而試驗組 中的氨基酸態氮在前 60 d 一直保持上升趨勢，直 至 60 d 時才趨于平穩。 這是由于添加魯氏酵母與 球擬酵母后，在前期酵母大量繁殖，消耗較多氨基 酸。 因此在 30～50 d 時，試驗組中的氨基酸態氮低 于對照組。 而 50 d 后，由于對照組中的氨基酸與 糖類發生美拉德反應消耗氨基酸， 而試驗組中的 這一過程發生在 60 d 后。由圖 2 可知，pH 呈現出不斷下降的趨勢，這 是由于在發酵過程中， 由于醬油中有機酸的不斷 產生。明顯可以看出，pH 下降最快的為Ⅳ組。這是 由于Ⅳ組添加了乳酸菌，乳酸菌可以利用糖類、檸 檬酸生成乳酸和醋酸， 從而產生以上現象。 并且pH 下降至 5 附近， 抑制了非耐酸雜菌的生長，同 時促進酵母的繁殖與發酵。 另外，酸性物質賦予了 醬油爽適的風味，改善醬油的口感。 并且酸性物質 的生成抑制了非耐酸微生物的繁殖， 但可以促進 醬油酵母的生長與繁殖，以及酒精發酵。由圖 3 可知，在發酵過程中，還原糖的含量呈 現先增加后減少的現象。 這是由于制曲時積累的 淀粉酶作用下，還原糖含量上升，和可利用多糖的 釋放。 而后期，由于美拉德反應以及微生物代謝 消耗還原糖，導致還原糖含量下降。
3 結論
通過對添加不同菌種組合發酵所得醬油的理 化指標以及風味物質的測定， 發現多菌種制曲高鹽稀態發酵的醬油特征風味物質含量更高， 品質 更好。 發酵過程中：（1）4 組的氨基酸態氮、 還原 糖、pH 等理化指標基本相似， 第Ⅳ組的氨基酸態 氮的值（1.378 g/100 mL）略 高 于 其 他 3 組；（2）魯 氏酵母促進了醬油中高級醇及芳香雜醇的生成， 球擬酵母促進了醬油中 4-EG、4-VG 的 生 成，使 醬油具有特殊的香氣， 乳酸菌發酵賦予了醬油爽 適的口感， 各組風味物質含量和種類差異非常顯 著；（3）對特征性風味物質含量與發酵時間進行曲 線擬 合，可得到數學關系式（如 y=-230.83+21.7 t-0.136 t 2 +1.27×10-4 t 3 ，第Ⅰ組），從關系式算出Ⅰ 組特征性風味物質最大值分別為：648.96 μg/L（Ⅰ 組，發酵周期 92 d）、852.90 μg/L（Ⅱ組，發酵周期 98 d）、982.51 μg/L（Ⅲ組，發酵周期 99 d）、1 897.55 μg/L（Ⅳ組，發酵周期 102 d）。 多菌種發酵的醬油 獲得了較高的特征性風味物質含量。 以上結果，對 醬油的多菌混合制曲發酵實踐生產中有一定指導意義。
