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將 3 mL 0. 1 g /L L-多聚賴氨酸溶液注入用于 接種細胞的 T75 培養瓶中過夜，用無菌 PBS 洗 3 次，每次 10 min，常溫，置于無菌超凈臺內，1 h 內 接種細胞。用于差速粘附及傳代的培養瓶和培養 皿無需此處理。眼科彎鑷、直鑷及彎剪需提前浸 泡酒精，高壓烘干。將細胞懸 液接種至未用多聚賴氨酸處理過的 T75 培養瓶 中，37 ℃、5% CO2 培養 15 min，吸出剩余未貼壁 的星形膠質細胞懸液，輕柔吹打混勻后，將細胞以 5× 106 /mL 接種至多聚賴氨酸包被預處理過的 T75 培養瓶，37 ℃、5% CO2 培養。每隔 3 d 換液， 待細胞融合到 90%左右時，進行下一步操作。 細胞長滿 瓶 底 后，更換完全培養基，37 ℃ 恒 溫 搖 床 200 r /min振蕩 18 h。將培養瓶中上清液迅速倒 掉，用 PBS 洗 3 次，將每瓶細胞加入 1 mL 0. 25% 胰蛋白酶 37 ℃ 消化，倒置顯微鏡下觀察，待細胞 突觸回縮、大部分細胞脫落時，加入完全培養基終 止消化。反復吹打瓶壁，收集細胞，用于實驗或 傳代。
將第一代( P1) 、第二代( P2) 、第三代( P3) 細 胞消化后取 100 μL 接種于 96 孔板中培養 4 h，加 入 MTS 溶液 20 μL 后，繼續在 37 ℃、5%CO2 博訊常溫培養箱（上海博迅HPX-9082MBE電熱恒溫培養箱）內孵育 4 h。每組重復 3 次，酶標儀檢測 λ = 490 nm 條件下吸光度值( A) 。免疫熒光法檢測星形膠質細胞特異性標志 GFAP，GFAP 陽性細胞在熒光顯微鏡下發出綠色 熒光，DAPI 染色后所有細胞的細胞核呈藍色，可見細胞胞體較大、突觸較長。隨機選取 3 個視野，計算陽性率為( 97. 86±0. 91) %。
星形膠質細胞的分裂高峰發生在動物胚胎晚 期及出生以后，同時大腦皮層中混雜的神經元在 出生后不再增殖，因此星形膠質細胞的來源一般 選擇新生哺乳動物。由于出生 1 d 內鼠腦較小， 大腦皮層不易剝離，且出生 3 d 后大鼠大腦溝回 開始形成，軟腦膜與腦組織不易剝離，會造成軟 腦膜中成纖維細胞的干擾，因此本實驗選取出 生 2 d 的 SD 大鼠作為細胞來源。生 2 d 的 SD 大鼠作為細胞來源。 此外，0. 25%胰蛋白酶消化組織的時間可影 響星形膠質細胞純度及增殖活力，消化 40 min 時 細胞會有明顯損傷，因此本實驗嚴格控制消化時 間在 15 min。值得注意的是，雖然目前大多數研 究者使用 0. 25%胰蛋白酶消化組織制備單細胞 懸液，但其中的胰蛋白酶添加量并未提及。本 實驗發現，胰酶添加量取決于組織塊的大小，添加 量過多會導致細胞過度消化，添加量過少導致組 織消化不充分。因此本實驗將胰蛋白酶添加量設 定為每 2 只鼠腦皮質加入 500 μL 胰蛋白酶，可避 免細胞消化過度，導致大部分細胞死亡。 差速貼壁法和恒溫振蕩法為星形膠質細 胞培養中最常用的方法。差速貼壁法利用了成纖 維細胞貼壁時間短，星形膠質細胞貼壁時間長的 特性，可以很好地分離兩種細胞。在部分研究中采用恒溫振蕩法以去除附著的小膠質和 少突膠質細胞，將細胞置于 37 ℃ 恒溫箱中，以 250 r /min 的速度進行振蕩，雖然能夠起到純化作 用，但得到的星形膠質細胞數量相對減少，因此本 實驗采用 200 r /min 的速度恒溫振蕩 18 h，得到相 對較多且純度較高的星形膠質細胞。
