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幽門螺桿菌是胃炎、消化性潰瘍和胃癌的重要致病因子。目前，臨床對幽門螺桿菌感染治療大多是經驗用藥，隨著感染人群中幽門螺桿菌耐藥菌株的 不斷增加，經驗性用藥治療失敗率越來越高。為指導 Ⅰ期臨床用藥，提高幽門螺桿菌治療精準性、敏感性， 迫切需要實驗室提供幽門螺桿菌培養和藥敏 結 果。 由于幽門螺桿菌需要在微需氧的特殊環境和較高營 養條件生長，實驗室培養成功率較低，使得許多醫院 都不愿開展幽門螺桿菌培養。近幾年來國內許多第 三方醫學檢驗機構針對臨床需求，紛紛開展幽門螺桿 菌培養和差異化服務。
１ 材料與方法
１．１ 儀器與試劑
１．１．１ 培養液種類
幽門螺桿菌轉運培養基（固－液 雙相）購自珠海經濟特區益民生物工程制品廠（批號： ２０１８０７３０）；血瓊脂平板購自鄭州安圖生物工程股份 有限公司（批號：２０１８０７２６Ｂ）；苛養菌藥敏瓊脂平板購 自 鄭 州 安 圖 生 物 工 程 股 份 有 限 公 司 （批 號： ２０１８０７１９Ｂ）。
１．１．２ 鑒定試劑
ＶＩＴＥＫ ＭＳ－ＣＨＣＡ 基質購自生 物梅里埃公司（批號：１００６０６２９８０）；尿素酶購自杭州 濱和微生物試劑有限公司（批號：１７０１０３）；觸酶和氧 化酶購自重慶龐通醫療器械有限公司（批號分別為： １８Ｄ０８０４和１８Ｄ１８０５）。
１．１．３ 儀器
梅里埃質譜儀 ＶＩＴＥＫ ＭＳ購自生物 梅里埃公司；ＴＤＲ－Ｙ１００型微需氧培養儀和微需氧培 養氣體（１０％二氧化碳＋１０％氫氣＋氮氣平衡氣）購 自湖南長沙天地人生物科技有限公司；標本運輸箱購 自廣州賽信冷鏈冷藏科技有限公司；博迅YXQ-75SII立式壓力蒸汽滅菌器（非醫用）； ＨＳＸ－２５０型電熱恒溫恒濕箱購自中儀國科（北京）科 技有限公司；ＤＷ－８６Ｌ３３８型－８０ ℃超低溫保存箱購 自青 島 海 爾 特 種 電 器 有 限 公 司；ＤＷ－ＹＷ１６６Ａ 型 －２５ ℃冰箱購自中科美菱低溫科技有限責任公司； ＤＷ－ＹＬ４５０型４ ℃冰箱購自中科美菱低溫科技有限 責任公司；ＢＳＣ－１５００ＩＩＢ２－Ｘ型生物安全柜購自山東濟 南鑫貝西生物技術有限公司；ＣＸ２１ＦＳ１Ｃ 型生物顯微 鏡和 ＢＸ４３Ｆ型攝像顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。
１．２ 方法
１．２．１ 樣本制備原代幽門螺桿菌標準菌株
ＡＴＣＣ４３５０４以 ＴＳＢ基質配制濃度為０．５麥氏濁度的 菌懸浮液（約１×１０８ ＣＦＵ／ｍＬ）。按以下步驟進行連 續稀釋，（１）１∶００稀釋：吸取上述細菌懸液０．１ ｍＬ 加入９．９ｍＬＴＳＢ中。（２）再１∶１００稀釋：吸經（１）稀 釋后懸液０．１ｍＬ 加入９．９ｍＬ ＴＳＢ 中。（３）再１∶ １００稀釋：吸經（２）稀釋后懸液０．１ｍＬ 加入９．９ｍＬ ＴＳＢ中。此 時 幽 門 螺 桿 菌 濃 度 為 （１００±１０）ＣＦＵ／ ｍＬ，然后將此濃度的幽門螺桿菌菌液加入運輸培養 基中，每支１ｍＬ，共７５支。此試驗重復３次。
１．２．２ 樣本包裝
將標本放置于特殊包裝箱中。包 裝箱必須具備，
（１）主容器用足量的吸附性材料進行 包裹，以便在發生滲漏時可以吸收所有液體。
（２）中 層包裝，為第２層耐用、水密性、防滲漏的包裝，把主 容器裝入其中并對其起保護作用。
（３）外包裝，中層 包裝置于外包裝內，并加墊適宜的緩沖材料。外包裝 應能保護其內容物在運輸時不受外界的影響，如遭受 物理性損壞。外層容器的最小一面的尺寸≥１０ｃｍ× １０ｃｍ。將制備完成的樣本放置于特殊包裝箱中進行 相關貯存試驗。
１．２．３ 樣本貯存
把已接種菌液的幽門螺桿菌運輸 培養基分別置于４、２５、３５、－２５、－８０ ℃環境中，分別 存放６．０、１２．０、２４．０、４８．０ｈ后進行微需氧培養。
１．２．４ 樣本的運輸
汽車運輸：將標本置于４ ℃冷 鏈運輸箱由本公司冷鏈運輸車運送至杭州金域醫學 檢驗所樣本接收組，并及時遞交至微生物室，所有樣 本存放總時間為７．０ｈ后接種。在車上時間為６．０ｈ。 火車運輸：將標本置于４ ℃冷鏈運輸箱，通過安檢并 進行交接登記。當日上午約９：００從杭州托遠，至下 午１５：００左右樣本到達廣州高鐵站，由廣州運務組提 貨，在１６：００前交接進入廣州金域標本組并及時遞交 至微生物室，所有樣本存放總時間為７．０ｈ后接種，在 車上時間約為６．０ｈ。飛機運輸：將標本置于４ ℃冷 鏈運輸箱，通過安檢并進行交接登記，由杭州經航空 運送到達廣州白云機場，并及時遞交至微生物室，所 有樣本存放總時間為７．０ｈ后接種。在空中時間約為 ２．５ｈ。
２ 結 果
固體培養到第３天時，幽門螺桿 菌生長良好，哥倫比亞血瓊脂平板上見透明、針尖樣 菌落形態；液體培養第３天時可見培養基明顯渾濁， 涂抹少量菌液于無抗菌藥物的哥倫比亞血瓊脂平板 培養，肉眼未見污染菌生長，并有透明、針尖樣的菌落長出；在無菌生理鹽水中：革蘭染色后細菌為革蘭陰 性，固體培養基中的幽門螺桿菌為螺旋狀、海鷗狀、ｓ 狀彎曲菌或短桿菌；液體培養基中的幽門螺桿菌則多 為螺旋短桿狀，亦見部分長絲狀細菌，有的互相纏繞 聚集成團，有的散在分布，革蘭染色結果見圖１
樣本貯存溫度與存放時間對結果有非常顯著性影 響。在２４．０ｈ內相同貯存時間以貯存４ ℃時培養陽 性率最高（４０．４％±５．１％），與其他各組比較差異有 統計學意義 （Ｐ＜０．０５）；在 貯 存 ６．０ｈ 以 內 以 貯 存 ２５ ℃時陽性率最高（７１．２％ ±８．１％），與 ３５、－２５、 －８０ ℃比較，差異有統計學意義（Ｐ＜０．０５）。不同貯 存時間以－８０ ℃結果最穩定，結果見表１。
３ 討 論
幽門螺桿菌為革蘭染色陰性無芽胞、呈螺旋狀彎 曲的桿菌，不僅寄生于胃腸道，而且在口腔及呼吸系 統均分離到細菌，在人群中感染率達５０％以上。據報 道，幽門螺桿菌感染是消化系統慢性炎癥、胃部潰瘍、 胃黏膜淋巴組織異常和淋巴瘤的主要致病菌和胃癌 的一級致癌因子。目前對幽門螺桿菌感染診斷方法種類眾多，不同方法檢出的陽性率差異明顯，有許 多確定性方法如病理檢查、基因診斷等。但如果進 行致病機制、細菌分型、耐藥菌株、疫苗制備等研究， 幽門螺桿菌培養法是“金標準”。
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