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三葉青（ｒａｄｉｘｔｅｔｒａｓｔｉｇｍａｔｉｓｈｅｍｓｌｅｙａｎｉ），又名蛇附子、石老鼠、石猴子、石抱子等，為葡萄科崖爬藤 屬植物三葉崖爬藤。它主要分布于中國浙江、安徽、江西、云南、貴州等地，具有清熱解毒、消腫散結、活 血化瘀等功效。三葉青中含有多種有效的化學活性成分，多糖便是其中之一。研究表明，三葉青多糖 具有復雜的生物活性和功能，如降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗肝損傷、調節免疫等。目前研究人員提取三 葉青多糖的方法大多為傳統的水提醇沉法、酸堿提取法、索氏提取法等，這些傳統的提取方法普遍存在 提取溫度高、耗時長、效率低、溶劑消耗大且多糖的空間結構易被破壞等缺點。
１ 材料與儀器
１．１ 材 料
纖維素酶（ＢＲ，國藥集團化學試劑有限公司，批號２０１８０３０９）；葡萄糖（ＡＲ，天津市大茂化學試劑廠）；鹽 酸（ＡＲ，上海凌峰化學試劑有限公司）；硫酸（ＡＲ，上海凌峰化學試劑有限公司）；苯酚（ＡＲ，杭州雙林化工試 劑廠）；１，１－二苯基苦基苯肼（ＤＰＰＨ，ＡＲ，北京冬歌生物科技有限公司）；無水乙醇（ＡＲ，永華化學科技有限公 司）；ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ（ＡＲ，天津市大茂化學試劑廠）；水楊酸（ＡＲ，上海凌峰化學試劑有限公司）；３０％Ｈ２Ｏ２ 溶 液（ＡＲ，杭州高晶精細化工有限公司）；三葉青塊根（浙江麗水三葉青珍稀植物研究所，產地浙江麗水）。
１．２ 儀 器
高速多功能粉碎機（永康市天祺盛世工貿有限公司，ＣＳ－７００）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限 公司，ＢＳ２２４Ｓ型）；循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司，ＳＨＺ－ＤⅢ型）；電熱恒溫水浴鍋（杭州藍天 化驗儀器廠，ＤＫＳ－２４型）；７５２紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；冰箱（博西華家用電 器有限公司，ＢＣＤ－２１２型）；數顯鼓風干燥箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠，９０７０ＭＢＥ 型）；ｐＨ 計 （上海佑科儀器儀表有限公司，ＰＨＳ－３Ｃ型）。
２ 試驗方法
２．１ 標準曲線的建立
２．１．１ 標準溶液的制備
準確稱取干燥至恒重的葡萄糖５０ｍｇ于２５０ｍＬ容量瓶中，加去離子水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配 得葡萄糖標準溶液（０．２ｍｇ／ｍＬ）。
２．１．２ 最大吸收波長的確定
吸?。保埃恚痰钠咸烟菢藴嗜芤?，置于１０ｍＬ具塞試管中，加去離子水至２．０ｍＬ，加６．０％苯酚溶液 １．０ｍＬ后，立即加入５．０ｍＬ濃硫酸混勻，靜止１０ｍｉｎ，搖勻，室溫放置２０ｍｉｎ。同時?。玻埃恚倘ルx子 水作為空白對照。在分光光度計上測定波長４５０～５５０ｎｍ 處的吸光度，確定其最大吸收波長。根據 試驗結果，吸收波長為４９２ｎｍ 時，樣品溶液的吸光度最大，故本試驗選取的吸收波長為４９２ｎｍ。
２．１．３ 葡萄糖標準曲線的繪制
精確量取葡萄糖標準溶液０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０ｍＬ，置于１０ｍＬ具塞試管 中，加去離子水至２．０ｍＬ，加６．０％苯酚溶液１．０ｍＬ后，立即加入５．０ｍＬ濃硫酸混勻，靜止１０ｍｉｎ，搖 勻，室溫放置２０ｍｉｎ。同時?。玻埃恚倘ルx子水作為空白對照，按上述方法操作，于最大吸收波長處測其 吸光度，并繪制葡萄糖標準曲線。
２．２ 纖維素酶法提取三葉青多糖的工藝流程
將三葉青塊根用粉碎機粉碎，準確稱取三葉青粉末５．０ｇ及適量的纖維素酶，加入一定量的稀酸液 并結合ｐＨ 計調節溶液ｐＨ 值為５，在一定溫度條件下提取三葉青多糖。一段時間后將其置于９０ ℃水浴 鍋中滅活５ｍｉｎ，再經過抽濾得到濾液，將濾液于２５０ｍＬ 容量瓶中定容，以用于接下來多糖提取率的測定。
２．３ 三葉青多糖提取率的測定
三葉青多糖提取率的測定采用苯酚－硫酸法。從２５０ｍＬ容量瓶中?。保埃恚淘囈河冢保埃恚倘萘?瓶中并定容。再從１０ｍＬ容量瓶中精密移?。埃担恚贪矗玻保车姆椒y定樣品吸光度，并按式（１）計算 三葉青多糖的提取率： Ｙ ＝ ［（Ｃ×Ｖ ×Ｄ）／Ｍ］×１００％。 （１） 式（１）中：Ｙ 為多糖提取率；Ｃ 為由標準曲線方程求得的多糖質量濃度，ｍｇ／ｍＬ；Ｖ 為待測液體積，ｍＬ；Ｄ 為稀釋倍數；Ｍ 為樣品質量，ｍｇ。
２．４ 單因素試驗設計
在酶法提取三葉青多糖的過程 中，影響多糖提取率的主要因素 有酶 加 量、酶 解 時 間、酶 解 溫 度、 ｐＨ、水料比（體積∶質量，ｍＬ／ｇ）、提取次數等。本試驗選擇酶加量、酶解溫度、酶解時間、水料比這 ４個因素分別進行單因素試驗。通過多次的預試驗，對各單因素條件的固定提取條件進行了設置，具體見表１。
３ 試驗結果與分析
以吸光度ｙ值為縱坐標，葡萄糖質量濃度ｘ 為橫坐 標，制作葡萄糖標準曲線，如圖１所示。標準曲線的回歸 方程為：ｙ＝５７．７６７ｘ－０．０１７，Ｒ２ ＝０．９９９４，表明吸光度 在葡萄糖標準溶液質量濃度為０．００５～０．０３ｍｇ／ｍＬ范 圍內線性關系較好。隨著酶加量的增加，三葉青多糖提取率 增大，這一階段影響三葉青提取率的主要因素是酶含量。當酶加量達到０．３％時，三葉青多糖提取率達到最大；之后再增大酶加量，三葉青多糖提取率反而有所降低。這是因為此時影響三葉青多糖提取率的 圖２ 酶加量對三葉青多糖提取率的影響 Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｎｚｙｍｅｄｏｓａｇｅｏｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｙｉｅｌｄｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍｒａｄｉｘｔｅｔｒａｓｔｉｇｍａｔｉｓｈｅｍｓｌｅｙａｎｉ 主要因素是底物的量，此時酶的用量已達到飽和，沒有多 余的底物再有機會與纖維素酶反應；而且酶含量過高，也 可能會抑制酶的作用。因此，酶加量?。埃常?。
4 結 語
采用纖維素酶法提取三葉青中的多糖，考察了酶加量、酶解溫度、酶解時間及水料比４個因素對 多糖提取率的影響。通過單因素試驗和響應面試驗設計，明確了各因素對三葉青多糖提取率的影響大小 次序為：酶加量＞水料比 ＞ 酶解時間 ＞ 酶解溫度。最佳提取工藝條件為：酶加量 ０．２７４％，酶解溫度 ６０．５ ℃，酶解時 間 ６２．４ ｍｉｎ，水 料 比 ２５．８∶１，此 條 件 下 的 多 糖 實 際 提 取 率 為 １０．４７％。酶法提取三葉青多糖用時較短，提取率卻更高。本試驗得出的三葉青多糖提取優化工藝可為研 究與開發三葉青多糖提供試驗基礎。
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